11.6. A gyakorlat menete

Tisztítsa meg az üveglapokat. Az újabb szennyezések elkerülésre tartsa őket az oldalaknál, vagy viseljen kesztyűt. Ezután egy etanolos mosást is végezzen el az esetleges nukleáz enzimek eltávolítására, majd hagyja az üveglapokat megszáradni. Készítse el a szeparáló gélt a 11. 1. táblázatban szereplő recept alapján.

11.1. táblázat A különböző koncentrációjú PAGE gélek összetétele (végtérfogat 10 ml)

Gel %

30% Akrilamide (29:1)

(ml)

H2O 5x

(ml)

TBE 10%

(ml)

APS

(μl)

TEMED

(μl)

8 %

3.2

6.4

2.4

200

10

10%

4.0

5.6

2.4

200

10

12%

4.8

4.8

2.4

200

10

Az APS-t és a TEMED-et csak közvetlenül a készülékbe töltés előtt szabad az oldatba bemérni, hiszen ez indítja el a polimerizációt! Ezután öntse az oldatot a két üveglap közé, majd helyezze bele a fésűt. A polimerizáció után helyezze a gélt a vertikális elrendezésű készülékbe, a fésűt óvatosan távolítsa el. Adjon a kinyert DNS mintákhoz mintafelvivő puffert, majd vigyen fel a mintákból 10μl-t a gélre egymás mellé, a sorrendet gondosan feljegyezve. A poliakrilamid gélekben a minták futtatására TBE puffert használjon. A futtatást jeges hűtés mellett végezze! Amíg a minta teljesen be nem vándorol a gélbe, a feszültséget 100V-ra (kb. 10 V/cm), ezután pedig 200V-ra (kb. 20 V/cm e) állítsa!

Amikor a jelzőfesték elérte a gél alját, a készüléket áramtalanítsa, szedje szét, minden alkatrészét gondosan mosogassa el, a gélt pedig helyezze etídium-bromidos oldatban, majd UV fényben analizálja!

- Az akrilamid neurotoxikus és karcinogén hatású. Mindig használjon kesztyűt!

- Akrilamid por kimérésekor elszívófülke, porálarc használandó!

Feladat:

10%-os poliakrilamid gél készítése, majd PCR termékek (100 bp hosszúságú fragmentek) futtatása, festése és értékelése.