12. fejezet - PCR a növényi molekuláris biológiában

szerző: Dr. Tamás László

Tartalom

12.1. A PCR módszer
12.1.1. A gyakorlaton alkalmazott két PCR módszer ismertetése
12.1.2. A szintetizált termék vizsgálata
12.2. A PCR reakció optimalizálása
12.2.1. Templát DNS kinyerése, tisztítása
12.2.2. Mg ion koncentrációja
12.2.3. Oligonukleotidok koncentrációja
12.3. Polimeráz enzim tulajdonságai
12.4. A reakcióelegy összemérése
12.4.1. Primer-dimer keletkezésének elkerülése, ’hot-start’
12.5. A PCR hőmérsékleti programja
12.6. A búzaliszt és a tészta
12.6.1. A liszt összetétele
12.7. A gyakorlaton vizsgált nukleinsav szekvenciák kapcsolata a liszt tulajdonságaival
12.7.1. A D genom alegységfehérjéi
12.7.2. A Bx7 HMW-GS fehérje
12.8. Gyakorlat
12.8.1. Genomi DNS kinyerése a 12.1. táblázatban megadott négy búzafajta leveléből
12.8.2. DNS minták ellenőrzése
12.8.3. Határozza meg gradiens PCR program alkalmazásával, hogy mely DNS mintában van az 1Dx2, illetve az 1Dx5 HMW-GS allél!
12.8.4. Határozza meg nested PCR módszerrel, hogy mely DNS mintában van a normál, illetve a nagy mennyiségben termelődő Bx7 HMW-GS fehérje génje!
12.8.5. Határozza meg mely minta tartalmazza a GM búzára jellemző uidA gént!

PCR módszerek alkalmazása búzafajták azonosítására

A gyakorlat célja: búzafajták azonosítása tartalékfehérje génjeik alapján PCR alapú markerek alkalmazásával.

Bevezetés

12.1. A PCR módszer

A polimeráz láncreakció során szekvenciaspecifikus oligonukleotidok segítségével megsokszorozzuk a növény genetikai állományának egy jól meghatározott darabját. A reakcióhoz szükséges egy hőstabil polimeráz enzim, valamint puffer, négy különböző dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTP), Mg2+, DNS templát és két oligonukleotid. Ez utóbbi két rövid DNS szakasz, azaz primer szükséges a kiegészítő (komplementer) DNS szál szintézisének elindításához. A kiválasztott DNS szakasz nagy mennyiségű – agaróz gélen látható – előállítását biztosítja a ciklusba szervezett három lépés (denaturálás, kapcsolás, lánchosszabbítás) többszöri (25 - 45) ismétlése. A reakció során a DNS mennyisége exponenciálisan nő a 2 hatványai szerint. A reakció hatékonysága azonban nem mindig éri el a 100 %-ot, ami csökkenti a szintetizált DNS mennyiségét az elméletileg várt értékhez képest. Ennek oka lehet az enzimpreparátum minősége (szennyezettség, alacsony féléletidő), a DNS nem megfelelő tisztasága, a reakcióelegy különböző komponenseinek alacsony koncentrációja, esetleges szennyezettsége, továbbá a rosszul megválasztott (magas) ciklusszám is.

(Búza genomi DNS preparátumban 0,6 fg mennyiségben lévő DNS szakaszból 36 ciklus során, 70%-os hatékonyság mellett 70 ng DNS szintetizáltatható.)

12.1.1. A gyakorlaton alkalmazott két PCR módszer ismertetése

A PCR reakció többek között alkalmazható analitikai és preparatív célokra is. Az analitikai célok között szerepelhet egy adott szekvencia létének kimutatása a növény genetikai állományában, vagy egyszerű nukleotid mutációk (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), ill. metilációs helyek vizsgálata. Mindkét esetben többféle megközelítés is alkalmazható.

12.1.1.1 Nested PCR

A szekvencia kimutatására a hagyományos módszer mellett alkalmazzák az úgynevezett nested PCR-t, melynek során két egymást követő PCR reakcióban sokszorozzák meg a keresett DNS szakaszt olyan mennyiségben, hogy az agaróz gélen kimutatható legyen. A ’nest’ szó magyarul fészket jelent, amit a módszernél úgy lehet értelmezni, hogy a második szintetizálódó DNS molekula az elsőre kapott szakasz belsejében, azaz azon belül található (lásd 12.1. ábra).

Példa a nested PCR-re. A második PCR reakcióban a Bx7BF és Bx7BR primereknek (zöld nyilak által közrefogott szakasz) az első PCR reakcióban, a BxKF és BxKR (piros nyilak) által felszaporított termék jelenti a templát DNS-t.

12.1. ábra Példa a nested PCR-re. A második PCR reakcióban a Bx7BF és Bx7BR primereknek (zöld nyilak által közrefogott szakasz) az első PCR reakcióban, a BxKF és BXKR (piros nyilak) által felsokszorozott termékek szolgálják a templát DNS-t.

Az első reakció során előállított, valamivel nagyobb méretű DNS fragment a következő PCR reakcióban – hígítás után – templátként szolgál. Ezt a bonyolult, összetett módszert annak ellenére alkalmazzák, hogy az alap módszerhez képest nagyobb a keresztszennyeződés veszélye, mivel a reakciócsövet ki kell nyitni, a mintákat hígítani kell. A módszer előnye, hogy nagyon kis mennyiségű DNS molekula (alacsony DNS koncentráció) esetén is detektálható mennyiségű DNS-t állíthatunk elő anélkül, hogy túlzottan magas ismétlésszámú reakciót kellene elvégezni. Ilyenkor olyan nagy koncentrációban kellene használni a reakcióelegy egyes komponenseit, hogy valószínűleg csökkenne a reakció specifikussága.

A nested módszer alkalmazásának másik területe, amikor nagyon hasonló szekvenciájú DNS szakaszok közül kell kimutatni egy keresett fragment meglétét a genomban. Egyetlen PCR reakcióban nem tudnánk a kívánt specifikusságot és megbízhatóságot elérni, ezért van szükség a második reakcióra is. Az első lépésben tulajdonképpen szűkítjük a templátként szóba jöhető szakaszok számát, míg a második során teljesen specifikus lehet az amplifikáció. Egyes génekben, ill. promóter, vagy terminátor szekvenciákban meglévő méretbeli különbségek kimutatására is alkalmas a módszer. A szintetizálódott DNS meglétét, vagy hiányát, valamint méretét, annak polimorfizmusát agaróz gélelektroforézist követően, a gél festése után vizsgáljuk, ill. határozzuk meg.

12.1.1.2. Pontmutációk vizsgálata SNP PCR-rel

Az egyszerű, vagy pontmutációk (SNP) kimutatására alkalmas PCR módszer alapja, hogy a specifikus oligonukleotidok egyike (pl. a Forward típusú) optimális reakciókörülmények között nem kapcsolódik a mutáns szekvenciájú DNS-hez. Az oligonukleotid megfelelően választott bázissorrendje lehetővé teszi, hogy csak a ’vad’ típusú allélhez kapcsolódjon tökéletesen, hidrogénhíd kötéseken keresztül. A Reverz típusú primer olyan DNS szekvenciát ismer fel, a DNS olyan szakaszához kapcsolódik, amely mind a két allélban teljesen azonos. Az úgynevezett „kiegészítő” szál szintézise, az elmélet szerint, csak stabilan kapcsolódó kettős szálú DNS-en indul el. Ha a primer 3’ végi nukleotidja nem tud pontosan kapcsolódni a templát DNS-hez, akkor a polimeráz enzim működése gátolt. A példánknál maradva, a ’mutáns’ allélről nem, ellenben a ‘vad’ allélról szintetizálódik DNS. A PCR során keletkezett terméket általában agaróz gélelektroforézist követő festéssel (pl. etídium bromid) tesszük láthatóvá, UV fénnyel megvilágítva a gélt.

12.1.2. A szintetizált termék vizsgálata

Az elmúlt években a PCR módszertanának (készülék, DNS festék) fejlődése következtében lehetőség nyílt a termék keletkezésének valós idejű követésére is. Ezt nevezzük real-time PCR-nek. Ebben az esetben nincs szükség agaróz gélelektroforézisre és a gél festésére, hanem a keletkezett specifikus termék mennyiségét a fluoreszcencia mérés alapján tudjuk követni. A keletkezett kettős szálú DNS-hez kötődő festék (SYBRGreen) fluoreszcenciája arányos a termék mennyiségével. (Fontos megjegyezni, hogy a real-time PCR módszer alkalmazása SNP kimutatására csak a van-nincs kérdésre keresi a választ és nem mennyiségi kérdésekre.)

Mindkét kimutatási módszer csak akkor alkalmazható, ha a vizsgált minta homozigóta. Ha mindkét allél előfordulhat a növény genetikai állományában, azaz heterozigóta növényről beszélünk, akkor olyan amplifikált termékekre, ill. módszerre van szükség, ahol a ‘vad’ és ‘mutáns’ allélról keletkezett DNS fragment elkülöníthető.

TaqMan próba

Az egyik megoldás az úgynevezett TaqMan próba használata. A kétféle szekvenciának megfelelő fluoreszcencia hozam mérésével folyamatosan detektálható a ’vad’, a ’mutáns’, vagy mindkét allél jelenléte a reakcióelegyben a reakció során. A TaqMan próba egy a PCR reakcióban alkalmazott harmadik oligonukleotid, mely vagy a ’mutáns’, vagy a ’vad’ allélhoz képes specifikusan kapcsolódni a primerek által közrefogott rövid DNS-szakaszon belül. A kétféle próba két eltérő flourofórral (fluoreszkáló molekulával) jelölt a próba DNS 5’ végén. A polimeráz enzim – miközben szintetizálja az új DNS szálat – a templáthoz kapcsolódó DNS-t képes elbontani, mivel rendelkezik 5’ – 3’ irányú exonukleáz aktivitással is. Mivel az 5’ végi nukleotid ezután már nem kapcsolódik a próbához, és ezért a fluorofór csoportja felszabadul az oligonukleotid 3’ végén lévő ’Quencher’ molekula gátló hatása alól, így megfelelő hullámhosszon mérhető a fluoreszcenciája (12.2. ábra).

Az egy nukleotidban eltérő szekvenciájú (piros és kék négyzet), és eltérő fluorofórral (narancs és kék ellipszis) ellátott próba DNS-ek pontosan kapcsolódnak a templát DNS-hez, akkor a polimeráz lehasítja az 5’ végi nukleotidot, amely felszabadul a zöld körrel jelölt ’Quencher’ molekula gátló hatása alól és így mérhető lesz a jelölt nukleotid fluoreszcenciája. Ha a próba DNS nem tud kapcsolódni a templá DNS-hez a templát DNS-hez a fluorofór nem szabadul fel a ’Quencher’ gátló hatása alól és nem mérhető fluoreszcencia.

12.2. ábra SNP kimutatása TaqMan próba használatával.

Ha csak a ’vad’ allélhoz tud kapcsolódni a próba, akkor csak a ’vad’ allélra jellemző fluoreszcenciát, ha a ’mutáns’ allélhoz akkor az erre jellemző fluoreszcenciát mérhetjük. Ha mindkét allél jelen van a növényi genomban, akkor mindkét fluoreszcencia megjelenik a PCR reakció ciklusszámának növekedésével. A módszer gyors, megbízható és nagy mintaszámok esetén annak ellenére széles körben elterjedt, hogy drágább a hagyományos kimutatást alkalmazó PCR módszernél.

SYBRGreen alkalmazása

Mindkét termék egymás melletti detektálására alkalmas az úgynevezett Tm shift PCR módszer. Ebben az esetben mind a ’vad’, mind a ’mutáns’ allélhez kapcsolódni képes eltérő szekvenciájú oligonukleotid (pl. Forward primer) jelen van a reakcióelegyben, A két Forward típusú primer 5’ végi szekvenciájához eltérő hosszúságú, a templáttal nem komplementer plusz szakaszt szintetizáltatunk, így például a ’vad’ típust felismerő primer néhány nukleotiddal hosszabb, mint a ’mutáns’ allélt felismerni képes primer. A keletkezett kétféle termék ennek következtében eltérő méretű és olvadáspontú. Ennél a példánál maradva, a ‘vad’ típusú allélról szintetizálódó termék olvadási hőmérséklete magasabb. Az olvadási hőmérséklet jól vizsgálható a reakció befejezése után SYBRGreen jelenlétében. Az olvadási görbe első deriváltja megadja a szignoid görbe inflexiós pontját, ill. pontjait. A matematikai művelet eredményeként kapott függvény egy, ill. két csúcsa megmutatja a szintetizálódott termék (termékek) olvadáspontját. Homozigóta minta esetén egyetlen csúcsot kapunk a fluoreszcens jel mérése és feldolgozása után, melynek azonosítása a két allélhoz tartozó hőmérsékleti érték alapján történik. Heterozigóta minta esetén a függvény két maximumot mutat.