12.2. A PCR reakció optimalizálása

Az SNP megbízható kimutatásához szükséges a reakció nagyon pontos optimalizálása. Az optimalizálás a reakcióelegy szinte minden komponensére értelmezhető, ami elsősorban a megfelelő koncentráció alkalmazását jelenti. Az alkalmazott templát DNS mennyiségének meghatározásakor azonban gondolni kell a preparátum tisztaságára is.

12.2.1. Templát DNS kinyerése, tisztítása

Különösen magas olaj, keményítő, vagy másodlagos anyagcseretermékeket tartalmazó növényi részekből kinyert DNS esetében fontos a megfelelő tisztaság elérése. A szennyező komponenseket, ha szükséges, extra tisztítási lépések során kell eltávolítani. Nehézséget jelent a sejtek feltárása, pl. elszáradt vagy fás növényi részek esetében. A minta porításához ilyenkor nemcsak dörzsmozsarat, rázógépet vagy kalapácsot használnak, hanem folyékony nitrogént és kvarchomokot is (lásd a DNS kinyerés fejezetet). Több biotechnológiai cég fejlesztett ki speciális célokra szolgáló DNS kinyerő, tisztító kit-eket. Az oldat koncentrációját, tisztaságát spektrofotométerrel mérjük (lásd …. fejezet). Csak a megfelelő minőségi és mennyiségi paraméterekkel rendelkező DNS preparátum használható PCR analízisre.

A reakcióhoz szükséges templát DNS mennyisége függ a növényi genom méretétől. Arabidopsis DNS-ből kevesebb kell, mint rizs DNS-ből, és ez utóbbiból kevesebb kell, mint búza DNS-ből. A genom méretén túl a kópiaszám is meghatározza a szükséges templát mennyiséget. SNP kimutatásnál egy kópiáról beszélhetünk, s ezért búzából 80-100 ng DNS-re van szükség, míg rizsből 20-40 ng, míg arabidopsis-ból már 5 ng alatti mennyiség is elegendő sikeres PCR reakcióhoz 10-20 µl reakció térfogatban.

12.2.2. Mg ion koncentrációja

Azon túl, hogy a polimeráz enzim megfelelő működéséhez Mg iont igényel, az oligonukleotidok specifikus kötődéséhez is nélkülözhetetlen, azaz biztosítani kell az optimális koncentrációt a reakcióelegyben. Magas koncentráció mellett a primer aspecifikus kapcsolódása esetén is stabilizálódhat a templáttal való kölcsönhatás, és ez hibás lánckezdéshez vezethet. Ennek következtében hamis pozitív eredményt kaphatunk. Alacsony Mg2+ koncentráció mellett nem elég stabil a DNS-DNS kölcsönhatás, így nem jön létre stabil kapcsolat, nem tud elindulni a lánchosszabbítás, ami pedig hamis negatív eredményre vezethet. Az MgCl2 vagy MgSO4 optimális koncentrációja a reakcióelegyben 1,5-5 mM között van. Az optimális értéket kísérleti úton kell meghatározni, 0,5 mM-os változtatásokkal, 1,5 mM koncentrációtól elindulva.

12.2.3. Oligonukleotidok koncentrációja

A reakcióhoz használt oligonukleotid törzsoldatok koncentrációját 10 mM Trisz/HCl puffer felhasználásával 10 µM értékre szokták beállítani. Ebből az oldatból adnak annyit a reakcióelegybe, hogy koncentrációjuk 100 nM és 500 nM között legyen. A magas koncentráció azon túl, hogy aspecifikus lánckezdéshez is vezethet, megnöveli a primer-dimer keletkezésének valószínűségét is, ha nem használunk ’hot-start’ polimeráz enzimet. Alacsony koncentráció esetén nem kapunk megfelelő mennyiségű terméket. A szükséges koncentrációt kísérleti úton kell meghatározni itt is, 200 nM koncentrációtól kiindulva.