12.4. A reakcióelegy összemérése

Már két DNS minta vizsgálata esetében sem külön-külön állítjuk össze a reakcióelegyet, hanem minden mintához egyszerre egy közös reakcióelegyet, mixet készítünk. A reakció mix nem tartalmazza természetesen a templát DNS-t és az enzimet. A reakció mix mennyiségét úgy kell meghatározni, hogy az eredmény megbízható értékeléséhez szükséges egy pozitív és egy (néhány esetben két) negatív kontroll minta is. A pozitív mintában kapott termék bizonyítja, hogy működött a reakció, hogy minden komponens rendelkezésre állt az enzim működéséhez, és egyben megadja a vizsgált mintákban várt DNS termék méretét is. A negatív kontrollként használt reakcióelegy DNS helyett molekuláris biológiai tisztaságú vizet tartalmaz, s így DNS nem keletkezhet benne. Transzgénikus növények DNS mintáinak vizsgálatakor egy második negatív kontroll mintát is összeállítunk, melyben nem transzgénikus növényből származó DNS van. A kimutatásra alkalmazott oligonukleotidok ezen a templáton nem adhatnak terméket, ill. ha kapunk terméket, annak mérete nem megfelelő. Az egyszerre vizsgált minták értékelése csak akkor megbízható, akkor fogadható el, ha mindkét, ill. mindhárom kontroll minta a vártnak megfelelő eredményt adta.

12.4.1. Primer-dimer keletkezésének elkerülése, ’hot-start’

A PCR reakció eredményeként kapott termék ellenőrzésekor többször megfigyelhető, hogy a termék mennyisége nem megfelelő, ill. aspecifikus termékek is keletkeznek. Ezek között különösen jelentős mennyiségben jelennek meg nagyon rövid méretű, nem specifikus termékek. A nagyon rövid aspecifikus DNS neve primer-dimer, mely az oligonukleotidok egymáshoz kapcsolódása miatt keletkezik. Ennek oka, hogy a primerek a jeges vízfürdőben rövid szakaszok átfedésével is képesek stabil kettős szálú DNS-t kialakítani, s nem csak primerként, de templátként is szolgálnak a reakcióelegyben jelen lévő polimeráznak. Az enzim, ha nagyon lassan is, de képes új szálat szintetizálni, s ezáltal ellenőrizetlen 3’ végű oligonukleotidok keletkeznek. Az enzim aktivitása az első denaturációs lépéshez felmelegedő oldatban egyre nagyobb, és ha talál kettős szálú DNS molekulákat, egyre nagyobb sebességgel végzi az új szál szintézisét.

A nem kívánt, hibás, specifikusságot rontó termék keletkezésének megakadályozása érdekében meg kell oldani, hogy a polimeráz csak a denaturációs lépés után tudja az első lánchosszabbítást elvégezni. Egyik lehetséges megoldás, ha az enzim csak azután válik aktívvá, hogy minden kettős szálú DNS denaturálódott. Az ilyen enzimeket ’hot-start’ enzimnek nevezzük. A ’hot-start’ enzim komplexet alkot egy másik fehérjével, s ezért átmenetileg elveszíti aktivitását. A hőmérséklet emelkedésével a denaturálódott hőlabilis fehérje már nem képes a kölcsönhatást fenntartani, s így az enzim aktív helye szabaddá válik. A kapcsolási hőmérsékleten létrejövő specifikus, kettős szálú DNS 3’ végén elindul a lánchosszabbítás, amely maximális sebességgel 72 oC-on folytatódik.

A viszonylag drága ’hot-start’ enzim használatán kívül másképp is csökkenthető az aspecifikus termékek keletkezési valószínűsége, ha úgynevezett ’hot-start’ módszert alkalmazunk. Ennek kivitelezése kétféle módon lehetséges. Az egyik esetben a nem ’hot-start’ enzimet a 95 oC-ra felmelegített reakcióelegybe pipettázzuk. Ennek a megoldásnak a legnagyobb veszélye a minták keresztbe szennyezése, ezért csak kevés minta esetén ajánlott az alkalmazása. A másik megoldás sokkal egyszerűbb, s ezért a szennyezés veszélye is sokkal kisebb. Ilyenkor a reakció mix-hez csak a legvégén adjuk a nem ’hot-start’ enzimet, majd gyors összekeverés után azonnal belemérjük a már templát DNS-t is tartalmazó reakciócsőbe, és azt a készülék előre felmelegített (95 oC) reakció blokkjába helyezzük. Nagy mintaszámokkal azonban ebben az esetben sem szabad dolgozni, mert a mix kimérésével túl sok idő telik el, s addigra az utolsó mintákban a korábban leírt folyamatok lejátszódhatnak.