12.5. A PCR hőmérsékleti programja

A PCR hőmérsékleti programjának összeállítása során figyelembe kell venni a keresett DNS-fragment hosszát, a GC tartalom arányát, az oligonukleotidok hosszát, szekvenciáját és az alkalmazott enzim tulajdonságait.

Az első lépés a növényi DNS teljes denaturációja, amikor a kettős szálú DNS egyszálúvá válik. Ezt általában 95-97 oC-on végzik a templát DNS méretének függvényében 1-től 5 percig. Ha a polimeráz enzim egy ’hot-start’ enzim, akkor ez a legelső lépés 7-10 perc(az enzimet előállító cég előírása szerint), hogy a hő labilis fehérje partner tökéletesen denaturálódjon. Az ezt követő általában 3 lépéses ciklus első eleme a kapcsolás, amikor a Forward és a Reverz típusú primerek pontosan kapcsolódnak a templát DNS szálhoz. A kapcsolás pontossága, specifikussága egyértelműen meghatározza a PCR reakció sikerét. A kapcsolási hőmérséklet mindig alacsonyabb, mint az olvadási hőmérséklet. Az olvadási hőmérsékletet elsősorban az oligonukleotid összetétele határozza meg. Pontos értéket megállapítani csak kísérleti úton lehetséges, mert a számolására alkalmas algoritmusok nem tudnak minden körülményt tökéletesen figyelembe venni. Alacsonyabb hőmérséklet választásánál sok aspecifikus termék keletkezik, mely „szennyezi” a kísérlet során keresett, kimutatandó DNS fragmentet, míg magasabb hőmérséklet választásakor nem kapunk terméket. Az optimális kapcsolási hőmérséklet meghatározásához az első PCR reakcióban 5 oC-kal alacsonyabb értéket állítanak be, mint amennyi a számított olvadási hőmérséklet. Az eredménytől függően emelik vagy csökkentik a kapcsolás hőmérsékletét. A kapcsolás idejét a hőmérséklet emelésekor növelni, fordított esetben csökkenteni szokták. A kapcsoláshoz szükséges inkubáció idejét általában 15-20 másodperc között választják, ha 55 oC a kapcsolási hőmérséklet.

A kiegészítő DNS szál szintézise, az elongáció hőmérséklete többnyire 72 oC, de időnként ettől alacsonyabbat is szoktak alkalmazni. Ezt a polimeráz enzim tulajdonságai határozzák meg, amit a gyártó cég megad. A lánchosszabbítás ideje függ az enzim sebességétől és a szintetizálni kívánt termék hosszától. Ha nem említik külön, akkor általában 1000 nukleotid/perc sebességgel számolnak. A rekombináns Taq polimeráz esetében akár 6000 nt/perc is lehet, míg a Pfu polimeráz sebessége csak 1000 nt/2 perc körül van.

A harmadik lépés a PCR ciklusban a denaturáció. A szintézis során megkettőződött DNS-ből újra egyszálú DNS-t kell előállítani. A denaturáció hőmérséklete általában 94-95 oC, s hossza ritkán haladja meg az egy percet, inkább 30 másodperc körül szokott lenni. Nagyméretű PCR termék (> 4 kbp) esetén természetesen egy percnél hosszabb időtartamot kell beállítani.

A fentebb leírt 3 lépéses ciklust többször ismételve érhető el a megfelelő mennyiségű DNS előállítása, felszaporítása. A ciklusok száma igen széles intervallumban változik, de ritkán megy 25 alá és 45 fölé. Az első esetben nem mindig szintetizálódik elegendő mennyiségben a DNS, míg a második esetben a reakcióelegy egyes komponenseinek koncentrációja sebesség meghatározó lehet, így csökken az enzim aktivitása és a polimeráz reakció hatékonysága.

A fentebb leírt lépések, időintervallumok a hagyományos PCR módszerre jellemzők. Ezt követve egy 1 kbp hosszúságú DNS molekula felszaporítása növényi genomból 36 ciklusos PCR keretében kb. 2 órát vesz igénybe. Az utóbbi időben egyre elterjedtebb ’fast PCR’ módszer alkalmazásával az idő 35-40 percre rövidíthető. A szükséges feltételek között három jelentős van. i) A készülék blokkjának hőmérsékletét gyorsabban kell változtatni, így lerövidül a felmelegítés és a lehűtés időtartama. (Általában kisebb reakciótérfogatot is választanak a gyors hőmérséklet átadáshoz az elegyben.) ii) A polimeráz enzim lánchosszabbítási sebessége magas (6000 nt/perc). Érdemes a gyártótól vásárolni PCR mixet, amelyhez csak az oligonukleotidokat és a templátot kell hozzáadni. iii) A program szervezése is eltér a hagyományostól. A kezdeti denaturáció magasabb hőmérsékleten rövidebb ideig tart (98 oC, 30 másodperc) a ’hot-start’ enzim aktivizálásával együtt, továbbá a 3 lépéses ciklust 2 lépésessé alakítják úgy, hogy a kapcsolási és lánchosszabbítási lépést összevonják. Ezen kívül csökkentik a kettő együttes idejét is (65 - 72 oC, 20 másodperc). A denaturáció inkubációs ideje nagyon rövid, 1-5 másodperc.