12.7. A gyakorlaton vizsgált nukleinsav szekvenciák kapcsolata a liszt tulajdonságaival

12.7.1. A D genom alegységfehérjéi

A legismertebb allélpár az 1Dx2-1Dy12 és az 1Dx5-1Dy10, melyek minőségre gyakorolt hatását részletesen tanulmányozták először keresztezési kísérletekben (in vivo), később pedig molekuláris biológiai módszerekkel (in vitro) is. A tisztított natív és heterológ rendszerekben termeltetett fehérjékkel, valamint transzgénikus búza növényekből kinyert lisztekkel végzett kísérletek megerősítették a korábbi következtetéseket és eredményeket. A molekuláris biológiai módszerek bevezetésén túl jelentős hatással volt e terület fejlődésére a szerkezet-funkció vizsgálatokat megkönnyítő kis mintamennyiséget (2-4 g liszt) igénylő módszerek kidolgozása és elterjedése. A 2+12 fehérjét tartalmazó búzafajtákból általában gyengébb minőségi paraméterekkel rendelkező tészta készíthető, mint az 5+10 fehérjéket tartalmazókból. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy míg az Dx2 HMW glutenin fehérjében csak 3 cisztein aminosav található az N-terminálison, amiből az egyik alkalmas molekulák közötti diszulfid híd létrehozására, addig az Dx5 HMW fehérjében van egy további SH csoport is, ami a polimer fehérjelánc elágazódásához vezethet. A negyedik cisztein aminosav valószínűleg egy pontmutáció során keletkezett a Dx2 HMW glutenin fehérje génjéből.

A pontmutáció alapján tervezhető olyan primer, amely megfelelően választott kapcsolási hőmérséklet mellett PCR reakcióban meg tudja különböztetni az 1Dx2 és az 1Dx5 HMW-GS alléleket egymástól (12.3. ábra). Ez az SNP marker segít a hagyományos nemesítésben az utódnemzedékek szelekciójában.

A búza D genomján kódolt két HMW glutenin alegységfehérje szekvencia részlete, valamint a két gén megkülönböztetésére tervezett primer szekvenciája.

12.3. ábra A búza D genomján kódolt két alegységfehérje génje közötti pont mutáció (SNP) megkülönböztetésére tervezett primer.

A különböző minőségi osztályba tartozó búza sütőipari tulajdonságait az egyes HMW glutenin alegységfehérjék jelenléte és relatív mennyisége egyaránt befolyásolja. A Bánkúti 1201 tájfajta, bár az 1Dx2-1Dy12 allélpárt tartalmazza, egyes törzseinek lisztjéből mégis kiváló reológiai tulajdonságú tésztát lehet gyúrni. Ennek egyik oka nagy valószínűséggel, hogy a D genomon kódolt HMW glutenin alegységfehérjék mellett más HMW-GS fehérjéknek is erős hatásuk lehet a tészta minőségére, még ha kisebb mértékben is.

12.7.2. A Bx7 HMW-GS fehérje

SDS-PAGE módszerrel vizsgálva az egyes búzafajták tartalékfehérje-mintázatát és mennyiségét megállapítható, hogy a Bx7 HMW-GS fehérje mennyiségében eltérések vannak. Funkcionális vizsgálatokkal bizonyították, hogy a Bx7 HMW alegységfehérje mennyiségének növekedése a tészta erősségének, rugalmasságának növekedését vonja maga után. Ez, mint előnyös tulajdonság, fontos a hagyományos nemesítésben, a jó sütőipari minőségű lisztet adó fajták előállításában, s ezért igény volt szelekciós marker kifejlesztésére. Kimutatták, hogy a Bx7 HMW-GS fehérjét nagy mennyiségben termelő búzafajtákban a gén promóter régiójában egy 43 bp hosszú inszerció található. Az erre létrehozott kodomináns marker megkülönbözteti az átlagos mennyiségű fehérjét termelő fajtákat (rövidebb méretű PCR termék) az úgynevezett túltermelő fajtáktól (hosszabb méretű PCR termék).

Transzgénikus búza

Az elmúlt években több genetikailag módosított búzafajtát hoztak létre, különböző tudományos gondolatok, ötletek bizonyítására. Tanulmányozták, vajon a GM búza megváltozott tulajdonságai megfelelnek-e az elméleti megfontolások alapján várt eredményeknek, valamint hogy az in vitro kísérletekben kapott eredményekből lehet-e egyértelmű következtetéseket levonni a növényben várható, megváltozott tulajdonságokkal kapcsolatban. Vizsgálták többek között, hogy hogyan lehet módosítani a szemtermés egyes tulajdonságait, például a szemkeménységet, az endospermium keményítő összetételét (amilóz-amilopektin arány), vagy a lisztből készült tészta reológiai tulajdonságait.

Az utóbbi tulajdonság módosításakor a keletkező fehérje hatásának vizsgálatához olyan búzafajtából indultak ki az egyik kutatási program keretében, amelyik nem termel, nem expresszál sem Dx, sem Dy típusú HMW glutenin alegységfehérjét. A búza genetikai állományába egy Cheyenne búzafajta eredetű, a Dx5 HMW-GS fehérjét kódoló gént juttattak. A DNS fragment tartalmazta a megfelelő méretű promóter és terminátor régiót is. A transzformálás során a pAHC25 plazmidot használtak ko-transzformációban, ami szelekciós markergént (pat gén, foszfinotricin acetil-transzferáz) és riporter gént (uidA, β-glükuronidáz/GUS) is tartalmaz. Az E. coli uidA gén transzkripcióját egy un. konstitutív (nem szövetspecifikus és folyamatosan működő) promóter, a foszfinotricin acetil-transzferáz génjét a kukorica Ubi-1 gén promótere irányítja. A GUS enzimet kódoló szekvencia mögött az Agrobacterium tumefaciens nopalin szintáz (nos) gén terminátora található. A GM növényben a termelt GUS fehérje hisztokémiai festéssel kimutatható.