12.8. Gyakorlat

12.8.1. Genomi DNS kinyerése a 12.1. táblázatban megadott négy búzafajta leveléből

Határozza meg a DNS preparátum koncentrációját és tisztaságát a 260 nm-en és 280 nm-en mért abszorbancia értékek segítségével (lásd a DNS kinyerés növényekből fejezetet)!

12.1. táblázat A gyakorlat során vizsgálandó búzafajták HMW-GS összetétele

Hígítással készítsen 100 ng/µl koncentrációjú DNS oldatot mind a négy DNS mintából!

12.8.2. DNS minták ellenőrzése

Meg kell győződni arról, hogy a tisztított DNS alkalmas-e PCR alapú vizsgálatra. Olyan primerpárt és olyan PCR programot kell használni, amikor a reakció eredményeként biztosan kapunk terméket. Erre alkalmas a Dx51 és a Dx52 jelű primerpár, mely az 1Dx HMW-GS allél jelenlétének kimutatására alkalmas 55 oC-on. Mind a négy mintában megtalálható vagy a Dx2, vagy a Dx5 HMW-GS fehérjét kódoló gén, és alacsony kapcsolási hőmérsékleten a Reverz típusú primer (Dx52) mindkét génhez képes kapcsolódni, és a lánchosszabbítás elindul. Ha a PCR reakció eredményeként valamelyik DNS mintában nem kapunk terméket, akkor lehetséges, hogy az a DNS minta nem megfelelő tisztaságú PCR vizsgálatokhoz. Ha szükséges, a reakciót kétszer, háromszor meg kell ismételni, vagy ha ez sem vezet eredményre, új DNS mintát kell preparálni.

A reakcióelegy összetételét a 12.2. táblázat tartalmazza.

12.2. táblázat A Dx allél kimutatására szolgáló reakcióelegy összetétele

A PCR program a 12.4. ábrán látható.

A Dx allél kimutatására szolgáló PCR reakció programja. Első ciklus (1x): denaturáció 95 oC 5 perc; második ciklus (36x): denaturáció 95 oC 15 másodperc, kapcsolás 55 oC 15 másodperc, lánchosszabbítás 72 oC 20 másodperc; harmadik ciklus (1x): lánchosszabbítás 72 oC 7 perc, hűtés 4 oC.

12.4. ábra A Dx allél kimutatására szolgáló PCR reakció programja.

A reakció során keletkezett terméket, annak mennyiségét és méretét 1%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel ellenőrizzük (lásd a Nukleinsavak elválasztásának módszere fejezetet). Egyetlen, 450 bp hosszú terméket várunk.

12.8.3. Határozza meg gradiens PCR program alkalmazásával, hogy mely DNS mintában van az 1Dx2, illetve az 1Dx5 HMW-GS allél!

Ha ellenőriztük és bizonyítottuk, hogy a DNS mintánk alkalmas további PCR alapú vizsgálatokra, akkor állítsunk össze két párhuzamos mintasort a 12.2. táblázatban megadottak szerint. Az elkészült reakció mixet kettéosztjuk (10 μl + 10 μl). Az egyik mintasorozatot az alacsony, míg a másikat a magas kapcsolási hőmérsékletű sorba (oszlopba) helyezzük, és végezzük el a PCR reakciót az 5. ábrán látható program segítségével.

A PCR készülékek egy csoportja (Gradiens PCR készülék) úgy programozható, hogy a mintatartó blokk minden egyes sora vagy oszlopa különböző hőmérsékletű lehet. A felhasználó által megadott hőmérsékleti intervallumot a készülék szoftvere osztja be 8 (sor) vagy 12 (oszlop) emelkedő értékre. A felhasználó a monitoron megjelenő értékek között választhat, hogy hova helyezze a mintákat tartalmazó reakciócsöveket.

A reakció után az egyes mintákat agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük. Alacsony (55 oC) kapcsolási hőmérséklet mellett minden mintában kell terméket kapni, míg magas (63 oC) kapcsolási hőmérséklet mellett csak az 1Dx5 HMW-GS allél génjét tartalmazó reakcióelegyben (2 minta) kaphatunk terméket.

A PCR program az 12.5. ábrán látható.

Gradiens PCR reakció programja változó kapcsolási hőmérsékletekkel. Első ciklus (1x): denaturáció 95 oC 5 perc; második ciklus (36x): denaturáció 95 oC 15 másodperc, kapcsolás 55-63 oC gradiens 15 másodperc, lánchosszabbítás 72 oC 20 másodperc; harmadik ciklus (1x): lánchosszabbítás 72 oC 7 perc, hűtés 4 oC.

12.5. ábra Gradiens PCR reakció programja.

12.8.4. Határozza meg nested PCR módszerrel, hogy mely DNS mintában van a normál, illetve a nagy mennyiségben termelődő Bx7 HMW-GS fehérje génje!

Az NT és TT 1Bx7-HMW-GS gént tartalmazó búzafajták megkülönböztethetők a promóter szekvenciában lévő méretbeli különbség alapján. A marker kifejlesztésekor nehézséget jelent, hogy a homeológ kromoszómákon kódolt HMW glutenin alegységfehérje gének promóter szekvenciái nagyon hasonlóak. Ilyen esetben egy rövid inszerció, deléció, vagy duplikáció kimutatására szolgáló specifikus primerpár tervezése nagy körültekintést igényel. Egyik megoldás lehet a nested PCR módszer alkalmazása, amikor az első PCR reakcióban a specifikus DNS szakasz koncentrációját erőteljesen megnöveljük, majd ezen belül mutatjuk ki, detektáljuk a méretbeli eltérést. Az első lépésben az úgynevezett külső primerpár segítségével megsokszorozzuk az 1Bx7 HMW-GS gén promóter mennyiségét a többi HMW gén promóterével szemben, majd a második lépésben ebben a mintában határozzuk meg a jellemző szakasz méretét a belső primerpár használatával.

Az első reakcióhoz az elegy összetételét a 12.3. táblázat mutatja.

12.3. táblázat Bx promóter vizsgálata nested PCR-rel. Az első (külső primerpár) reakció összetétele

A búza 1Bx7 HMW-GS gén promóterének vizsgálatára használt nested PCR első, a külső primerpárra alkalmazott programja. Első ciklus (1x): denaturáció 95 oC 5 perc; második ciklus (36x): denaturáció 95 oC 15 másodperc, kapcsolás 58 oC 20 másodperc, lánchosszabbítás 72 oC 1 perc; harmadik ciklus (1x): lánchosszabbítás 72 oC 7 perc, hűtés 4 oC.

12.6. ábra A búza 1Bx7 HMW-GS gén promóterének vizsgálatára használt nested PCR első, a külső primerpárra alkalmazott programja.

A PCR program a 12.6. ábrán látható.

A reakció során felszaporított DNS szakasz mérete kb. 1200 bp, melyet 1%-os gélben, agaróz gélelektroforézissel ellenőrizhetünk. (Előfordulhat, hogy nem látunk a gélen terméket, de ilyenkor is érdemes elvégezni a második reakciót.) Ha az agaróz gélen festés után több, eltérő méretű terméket kapunk az azt jelenti, hogy a PCR reakció nem volt specifikus. Ilyenkor jobb, ha megismételjük a reakciót, bár ebben az esetben is eredményes lehet a második PCR reakció, azaz meg tudjuk különböztetni az eltérő promóter szakaszt tartalmazó fajtákat egymástól. A külső primerpárral végzett PCR reakcióelegyből a második (belső primerpárral végzett) reakcióhoz 100x hígítást készítünk, és ezt használjuk templátként. Különös figyelmet fordítsunk arra, hogy elkerüljük a minták keresztbe szennyezését.

A második reakcióhoz az elegy összetételét a 12.4. táblázat mutatja.

12.4. táblázat Bx promóter vizsgálata nested PCR-rel. A második (belső primerpár) reakció összetétele

A búza 1Bx7 HMW-GS promóterének vizsgálatára használt nested PCR második, a belső primerpárra alkalmazott programja. Első ciklus (1x): denaturáció 95 oC 5 perc; második ciklus (36x): denaturáció 95 oC 15 másodperc, kapcsolás 60 oC 20 másodperc, lánchosszabbítás 72 oC 30 másodperc; harmadik ciklus (1x): lánchosszabbítás 72 oC 7 perc, hűtés 4 oC.

12.7. ábra A búza 1Bx7 HMW-GS gén promóterének vizsgálatára használt nested PCR második, a belső primerpárra alkalmazott programja.

A PCR program a 12.7. ábrán látható.

A Bx7 HMW-GS fehérjét túltermelő (TT) búzafajtáknál egy 427 bp, a normál termelőknél (NT) egy 384 bp hosszú terméket kapunk. A két fragmentet meg tudjuk különböztetni 1,5% agaróz gélen végzett elektroforézis után.

12.8.5. Határozza meg mely minta tartalmazza a GM búzára jellemző uidA gént!

A transzgénikus búza genetikai állományában jelen van a pAHC25 plazmid által kódolt információ is. Ebben a plazmidban található gének terméke vagy szelekciós előnyt jelent a transzgénikus búza vonalaknak foszfinotricin kezelés esetén, vagy felhasználható a transzkripció és a transzláció gyors ellenőrzésére. A termelődő GUS enzim hisztokémiai festéssel már a fejlődés korai stádiumában egyszerűen kimutatható a regenerált növény leveleiben, míg a tartalékfehérje csak a szemtermésben expresszálódik.

A riporter gén kimutatására olyan primerpárt használunk, melyből a Forward típusú primer az uidA gén 3’ végéhez közel kapcsolódik, míg a Reverz típusú gén a NOS terminátorhoz.

A reakcióelegy összetétele a 12.5. táblázatban látható

12.5. táblázat Az uidA riporter gén kimutatására szolgáló reakcióelegy összetétele

A PCR program a 12.8. ábrán látható.

Az uidA riporter gén kimutatására szolgáló PCR reakció programja. Első ciklus (1x): denaturáció 95 oC 5 perc; második ciklus (36x): denaturáció 95 oC 15 másodperc, kapcsolás 58 oC 20 másodperc, lánchosszabbítás 72 oC 30 másodperc; harmadik ciklus (1x): lánchosszabbítás 72 oC 7 perc, hűtés lánchosszabbítás 4 oC.

12.8. ábra Az uidA riporter gén kimutatására szolgáló PCR reakció programja

A domináns marker a transzgénikus minta esetében egy 400 bp hosszú terméket ad, míg a nem GM búza mintából származó DNS esetében nincs termék.

Feladat

A kapott eredmények alapján határozza meg, hogy az egyes levélminták milyen búzából származnak a 12.1. táblázat segítségével! Ha szükséges, végezzen ellenőrző PCR vizsgálatokat is!