13. fejezet - Kvantitatív Real-Time PCR

szerző: Tóth Gábor

Tartalom

13.1. Elméleti áttekintés
13.1.1. PCR kinetika és fluoreszcens detekció
13.1.2. Real-Time PCR készülék
13.1.3. Az amplifikációs görbe és az alapvonal, küszöbérték, Ct fogalma
13.1.4. Standard görbe és PCR hatékonyság
13.1.5. Normalizáció
13.1.6. A kísérleti Kontroll és Kalibrátor minta
13.1.7. Olvadási pont meghatározás
13.1.8. Relatív mennyiségi meghatározási módszerek
13.2. Példafeladatok
13.2.1. Előkíséreltek
13.2.3. I. Példafeladat
13.2.4. II. Példafeladat

A Kvantitatív Real-Time PCR (Q-PCR) olyan PCR alapú módszer, mely lehetővé teszi a PCR ciklusok során keletkező termék valós idejű detekcióját és mennyiségi mérését. A módszer széleskörűen alkalmazható génexpresszió analízisre, genetikailag módosított organizmusok (GMO) kimutatására, SNP genotipizálásra, allél diszkriminációra, vírus terhelés mérésére.

13.1. Elméleti áttekintés

13.1.1. PCR kinetika és fluoreszcens detekció

A PCR ciklusok során a reakcióelegyben lévő vizsgálni kívánt templát DNS-hez (mely lehet genomi DNS, vagy cDNS) szekvenciaspecifikus oligonukleotidok kapcsolódnak, és az általuk közrefogott templát szekvencia (Target) felszaporodik. A megsokszorozódott templát szekvencia az amplikon. A vizsgálat céljától függően az amplikon lehet az érdekes gén egy szakasza - az angol szakkifejezésnek megfelelően - Gene Of Interest = GOI, vagy a Referencia gén (Reference) egy szakasza (lásd: Normalizáció).

Az amplikon optimális esetben minden ciklus során megkétszereződik, így a templátról keletkező DNS koncentrációjának növekedése exponenciális. A mérés fluoreszcencia detektáláson alapul. A reakció kezdeti ciklusaiban (1-10) az amplikon mennyisége a reakcióban eredetileg jelenlevő templát DNS-hez képest nem számottevő, így az exponenciális DNS koncentrációnövekedésnek megfelelő fluoreszcens jel erősödése a detekciós határ alatt van. Amikor az amplikon mennyisége meghaladja a templát DNS mennyiségét a reakció detektálhatóan az exponenciális szakaszba lép, amely a 10-30. ciklus közé eső intervallumra korlátozódik. A reakció késői ciklusaiban (ált. 30-40) előbb az elérhető szabad enzim és az amplikonok újraegyesülése válik limitáló tényezővé, majd a reakciókomponensek (primer, dNTP) kimerülésével a reakció platófázisba kerül.

Hagyományos detektálás során a PCR terméket a reakció platófázisában – agaróz gélelektroforézist követően – etídium-bromiddal jelöljük, amikor annak mennyisége már nincs összefüggésben a kezdeti templát mennyiséggel. Ennek megfelelően azt meg tudjuk mondani egy templát szekvenciáról, hogy benne volt-e a reakcióban vagy sem. Azonban azt, hogy milyen mennyiségben, csak más PCR-re épülő, összetett módszerek alkalmazásával tudjuk meghatározni, pl. szemi kvantitatív PCR, PCR-ELISA, Digital PCR.

A Real-Time PCR során a DNS mennyiségének mérése fluoreszcens detektáláson alapul, amihez kettős szálú DNS-hez kötődő fluoreszcens festékeket (SYBR Green I, EvaGreen) vagy fluoreszcensen jelölt szekvenciaspecifikus próbákat (pl.:Taqman, Hibridizációs próba, Molecular Beacon…stb.) használnak. A Q-PCR mérés alapvető feltétele, hogy a fluoreszcens jel erőssége egyenesen arányos legyen az amplikon mennyiségével.

A SYBR® Green I egy kettősszálú DNS-kötő fluoreszcens festék, melynek fluoreszcenciája kb. 2000-szer magasabb kettős szálú DNS-hez kötötten, mint szabadon. Gerjesztési maximuma 494 nm, emisszós maximuma 521 nm. A Real-Time PCR-ben a SYBR Green fluoreszcenciájának detekciója minden ciklusban a lánchosszabbítási lépés végén történik. Univerzális kettős-szálú DNS-kötő tulajdonságából következik, hogy bármilyen szekvenciához használható, ugyanakkor a fluoreszcens jel nem specifikus egy adott amplikonra. Különösen fontos ezért a primerek specifitása (lásd még: olvadási görbe), és a primer-dimer képződés elkerülése (lásd még: Hot Start).

A fluoreszcensen jelölt szekvenciaspecifikus próbák esetében a detekció általában a FRET (Fluorescens Resonance Energy Transfer) jelenségen alapul. A Taqman próba az amplikon egy rövid szakaszával komplementer egyszálú oligonukleotid, melyhez két fluoreszcens festéket kötnek: az úgynevezett Riporter-t és Quencher-t. A Riporter fluoreszcens emissziós spektruma átfed a Quencher gerjesztési spektrumával. A fluoreszcens próbákat úgy tervezik, hogy a két festék fizikailag közel legyen egymáshoz (maximum 10-100 Å). Alapesetben a Riportert gerjesztve nem detektáljuk annak fluoreszcenciáját, mert átadja az energiát a Quenchernek. A reakció során a Riporter és a Quencher eltávolodnak egymástól (pl. Taqman próba esetében a festékek közötti oligunukleotidot a Taq polimeráz 5’ -3’ exonukleáz aktivitásánál fogva lebontja). A FRET megszűntével a Riporterre jellemző fluoreszcens szignál detektálhatóvá válik, erőssége a reakció előrehaladtával az amplikon mennyiségének megfelelően nő.

13.1.2. Real-Time PCR készülék

Jelenleg sokféle Real-Time készülék található a piacon és a kínálat egyre bővül. A készülékekkel párhuzamosan a különböző fluoreszcens festékek és próbák száma is gyarapszik.

Fontos, hogy a kutató tisztában legyen az általa használt készülék alapvető működésével, fizikai képességeivel és korlátaival. Ezekről egy adott készülék használata előtt mindig érdemes tájékozódni.

Noha a működés részletei készülékről-készülékre változnak, minden esetben megtalálható 3 fő komponens: i) a fényforrás, ami meghatározza, hogy az adott készülék milyen fluoreszcens festékeket képes gerjeszteni; ii) a detekciós rendszer, amitől a detekció spektrális tartománya és érzékenysége függ; iii) a fűtés-hűtés mechanizmusa és egyben a minták elhelyezése (thermal cycler), ami a reakció sebességét és a minták pozíciójából adódó különbségeket határozza meg, valamint azt, hogy egyszerre hány minta vizsgálható az adott készülékben.

A műszer mellett a megfelelő szoftver alkalmazása jelentősen befolyásolhatja az adatok értelmezését. Fontos megjegyezni, hogy bár a legtöbb szoftver az automata adatelemzés különböző szintű lehetőségeit biztosítja, az így kapott eredmények nem lesznek annyira megbízhatóak, mintha a kutató manuális beállításokat (pl. alapvonal, küszöbérték…stb.) alkalmaz. Rendszerint lehetőségünk van az adatelemzés különböző fázisaiban a nyers, félkész vagy kész adatokat exportálni és MS Excel-ben megnyitni. Azon túl, hogy itt manuális adatelemzésre és különböző grafikus megjelenítésekre is lehetőségünk van, az Excel-ből importálva az adatokat más programokkal kiterjedtebb értékelést tudunk végezni (pl. geNorm és LinReg szoftverek).

13.1.3. Az amplifikációs görbe és az alapvonal, küszöbérték, Ct fogalma

A Riporter szignál a SYBR Green vagy fluoreszcensen jelölt specifikus próba fluoreszcens jele.

A passzív referencia festék a PCR reakció elegy komponenseivel nem reagáló, inert fluoreszcens festék (pl. ROX), melynek alkalmazása lehetővé teszi, hogy figyelembe vegyük a pipettázásból vagy fluoreszcens fluktuációból származó különbségeket az egyes minták között.

A Normalizált riporter szignál (Rn) a Riporter emissziós jelének és a passzív referencia festék emissziós jelének hányadosa. Az Rn változását (Δ Rn) a ciklusok függvényében ábrázolva az amplifikációs görbét kapjuk (13.1. Ábra.). Ez a PCR kinetikának és a detekció korlátainak megfelelően a következő részekre különíthető: lineáris, exponenciális, átmeneti és plató fázis.

13.1. Ábra. Amplifikációs görbe A. Y tengely lineáris nézetben; B. Y tengely logaritmikus nézetben; a görbe részei: lineáris (szürke), exponenciális (piros), átmeneti (lila), plató (kék). (ABI Prism 7000 szoftver)

Általában az első kb. 1-10 ciklusban a specifikus amplifikációból származó fluoreszcens jel keveset változik és nem lépi át a nem specifikus háttér (Background) fluoreszcenciát. Fluoreszcens próbák használata esetében ez származhat a nem megfelelő fluoreszcens kioltásból (a FRET gyengén működik), illetve SYBR Green kémiánál a nagy mennyiségű DNS templáthoz (pl. genomi DNS) kötődő SYBR Green fluoreszcenciájából. Az amplifikációs görbe első részét alkotó pontokra egyenes illeszthető, ez az alapvonal (Baseline). Az alapvonalat kezdeti és végpont ciklusszámmal definiáljuk.

A görbék exponenciális szakaszára a következő matematikai összefüggés érvényes: FN = C0 × 2N, ahol N az a ciklus szám, aminél a fluoreszcencia szintet vizsgáljuk, FN az N-edik ciklusban a fluoreszcens jel erőssége (= termék mennyisége), C0 a kiindulási templát szekvencia mennyisége. A mérés célja a C0 meghatározása, mivel a reakció kezdetén nagyon kis mennyiségben van jelen, ezért a C0-nak megfelelő fluoreszcens jel nem detektálható a háttér fluoreszcencia mellett. A reakció előrehaladtával az EXPONENCIÁLIS szakaszban mért amplikon mennyiségéből (FN) következtetünk a kiindulási templát szekvencia mennyiségére (C0), a fenti egyenletnek megfelelően.

A PCR görbe könnyebb elemzésének érdekében a fluoreszcens jel, Δ Rn logaritmusát ábrázoljuk a ciklusok függvényében. Ekkor az exponenciális szakasz lineáris formában jelenik meg, amire egyenest tudunk illeszteni (lásd: 13.1/B. Ábra.)

Az amplifikációs görbék exponenciális szakaszán kiválasztunk egy adott fluoreszencia szintet, ez a küszöbérték (Threshold). Azt a ciklust, ahol a görbe eléri ezt a fluoreszcencia értéket, küszöb ciklusnak nevezzük, rövidítése az angol kifejezésnek megfelelően lehet Ct (Threshold Cycle) vagy Cq (Quantification Cycle) vagy Cp (Crossing point) (lásd: 13.2. Ábra). A különböző reakciókban jelen lévő kezdeti templát szekvencia mennyiségét úgy tudjuk összehasonlítani, ha ugyanazon küszöbérték mellett vizsgáljuk őket. Ekkor az amplikon mennyisége minden reakcióban egyenlő, és a Ct értékek különbségéből következtetni tudunk a kiindulási templát mennyiségének különbségére: FN = C0 × 2N → FN(A)= C0(A) × 2Ct(A) = FN(B) = C0(B) × 2Ct(B). → Pl.: Ha A minta Ct értéke 1-el nagyobb, vagyis egy ciklussal később éri el ugyanazt a fluoreszcencia szintet (vagyis amplikon mennyiséget), mint B mintáé, akkor B minta mennyisége kétszer nagyobb, mint A mintáé. (Lásd még Δ Ct módszer.)

Minden amplikonhoz külön küszöbérték állítható be, de értelemszerűen csak az azonos küszöbértékkel rendelkező minták vizsgálhatóak együtt.

13.2. Ábra. Küszöbérték és Ct A fluoreszcens jel erősségét logaritmikus skálán ábrázoljuk a ciklusok függvényében. Az amplifikációs görbe lineáris szakaszán választunk egy fluoreszencia szintet (vízszintes zöld vonal), ez a küszöbérték. Azt a ciklust, ahol a görbe eléri ezt a fluoreszcencia értéket, küszöb ciklusnak nevezzük (Ct).

13.1.4. Standard görbe és PCR hatékonyság

Egy kitüntetett mintából (lásd pl.: Kontroll/Kalibrátor) hígítási sort készítünk. Ha a kitüntetett minta koncentrációja vagy a templát szekvencia kópiája pontosan ismert, akkor Abszolút standard sort, ellenkező esetben Relatív standard sort készíthetünk. A hígítási faktor a kétszerestől a tízszeresig változhat, és legkevesebb öt hígítási tagnak kell lennie. Pl.: 10, 100, 1000, 10000, 100000 kópia templát szekvenciát tartalmazó Abszolút hígítási sor; vagy 100x, 200x, 400x, 800x, 1600x hígított Relatív hígítási sor.

Meghatározzuk az egyes hígítási tagokhoz tartozó Ct értékeket (13.3A és B. Ábra), majd ábrázoljuk az ismert koncentráció, vagy hígítás logaritmusának függvényében (13.3C. Ábra). Az így kapott pontokra illesztett egyenes a Standard görbe. A Standard görbe minőségi követelménye, hogy az egyenes illesztés pontossága, vagyis a determinációs együttható R2 > 0,99 legyen.

A Standard görbe alapján egy ismeretlen minta Ct értékéből tudunk következtetni annak mennyiségére (lásd: Mennyiségi meghatározás Standard görbe alapján).

13.3. Ábra. Hígítási sor és Standard görbe Egy 100x, 200x, 400x, 800x, 1600x hígított Relatív hígítási sorhoz tartozó amplifikációs görbék lineáris (A) és logaritmikus (B) ábrázolásban. A vízszintes zöld vonal a küszöbérték. C: Az egyes hígítási tagokhoz tartozó Ct értékek a hígítás logaritmusának függvényében ábrázolva. Az így kapott pontokra illesztett egyenes a Standard görbe. A jobb felső sarokban az egyenes meredeksége, Y tengely metszete, és determinációs együtthatója látható. (ABI Prism 7000 szoftver)

Egy sok tagot tartalmazó és nagy koncentráció-intervallumot lefedő standard sor esetében a szélsőségesen tömény vagy túlságosan híg tagok nem illeszkednek az egyenesre, mert kiesnek a reakció dinamikus tartományából. Pontos mennyiségi meghatározás csak a dinamikus tartományon belül lehetséges. (A dinamikus tartomány felfogható úgy is, mint a legnagyobb koncentráció intervallumot lefedő Standard görbe.) A dinamikus tartomány vizsgált amplikononként különböző, alsó határát a detektálás érzékenysége, vagyis a reakció kémiája és a Real-Time készülék szabja meg. Felső határa szintén függ a készülék érzékenységégétől, bár a tömény mintáknál inkább érvényesül az ún. mátrix hatás, vagyis a reakcióelegy egyéb komponenseinek limitáló hatása. A különböző készülékek a 106-1012-szeres különbségek detektálására lehetnek alkalmasak. A nagy dinamikus tartománnyal rendelkező reakciók esetében pontosan megmérhetők a nagyon híg és a nagyon tömény minták is.

Ha egy sok tagot tartalmazó hígítási sor segítségével már meghatároztuk a reakció dinamikus tartományát, a további vizsgálatokban azt nem feltétlenül kell a Standard görbének teljes egészében lefednie. Ekkor a Standard görbe extrapolálása a dinamikus tartományon belül még pontos eredményhez vezet, azon túl azonban kerülendő.

A PCR kinetika alapján feltételezzük, hogy az exponenciális szakaszban az amplikonok mennyisége minden ciklusban megkétszereződik. Ez a tökéletes, 100% hatékonyságú PCR-re igaz. A gyakorlatban azonban ez ritkán valósul meg és a kívánt négyzetes emelkedés helyett, ennél alacsonyabb többszöröződést tapasztalunk. Mivel a mérés alapegyenlete exponenciális, a kezdeti mennyiséget nagy hibával becsüljük meg, ha a hatványalap 2-nél jelentősen kisebb. Minél nagyobb az eltérés a valós és az elméleti hatékonyság között, és minél későbbi ciklusokban (hatványkitevő) történik az összehasonlítás, a hiba annál nagyobb lesz.

Hagyományosan a Standard görbe meredekségéből becsülhető meg a reakció hatékonysága (Efficiency): E = 10(-1/m)-1 vagy 10(-1/m)-1×100 (%-ban kifejezve). Ennek megfelelően az alapösszefüggés így módosul: FN = C0 × (E+1)N. 100%-os reakcióhatékonyság esetén m = -3,322, E = 1. Ha a görbe meredeksége nagyobb (m<-3,222) a reakcióhatékonyság E<1, ha kisebb (m>-3,222) akkor a hatékonyság 100% felettinek tűnik (E > 1).

A Standard görbe módszer alkalmazásánál feltételezzük, hogy a reakcióhatékonyság a dinamikus tartományban minden mintára azonos. Ez azonban nem mindig igaz!

Lehetőségünk van megvizsgálni minden minta egyedi hatékonyságát különféle görbeillesztési módszerekkel. Ezen algoritmusok egy része az eredeti exponenciális lefutású görbét vizsgálja, mások pedig a logaritmikus görbe tulajdonságait. Ez utóbbi összefüggéssel például az amplifikációs görbék lineáris szakaszára illesztett egyenes képletéből tudunk egyedi reakcióhatékonyságot és kezdeti templát mennyiséget is számolni:

y = a×x +b → Log(FN) = Log(E ×C) + Log(C0) → E=10a és C0 =10b.

Egy adott vizsgált génre a reakció hatékonyságát az egyedi reakcióhatékonyságok átlagolásával becsüljük, és az átlagtól eltérő hatékonyságú reakciók könnyen azonosíthatóak. Az egyenletből számolt C0 értékek relatív mennyiségi összehasonlítást tesznek lehetővé.

Az egyedi amplifikációs görbék analízisére használható pl. a LinReg szoftver (13.4. Ábra.). A módszer előnye, hogy a reakcióhatékonyság számolása nem igényel külön Standard görbét. Hátránya, hogy jelentősen összetettebb és időigényesebb az eredmények értékelése.

13.4. Ábra. LinReg PCR szoftver Az egyedi amplifikációs görbék analízisére és Standard görbe nélküli reakcióhatékonyság becslésre használható szoftver. A logaritmikus nézetben ábrázolt amplifikációs görbe lineáris szakaszára illesztett egyenes képletéből egyedi reakcióhatékonyságot és kezdeti templát mennyiséget is számol. Egy adott vizsgált génre a reakció hatékonyságát az egyedi reakcióhatékonyságok átlagolásával becsli.

13.1.5. Normalizáció

A normalizáció a mért mennyiségi különbségek korrigálása egy általunk választott viszonyítási alaphoz képest. A normalizáció során a Real-Time reakcióval mért kiindulási templát szekvencia mennyiségét vonatkoztathatjuk a minta tömegére, a sejtszámra vagy a kinyert nukleinsav összmennyiségére. Választhatunk azonban más normalizációs alapot is, ún. belső Referenciát is, ilyenek lehetnek a riboszomális RNS mennyisége, vagy bizonyos állandóan és stabilan kifejeződő gének (például a housekeeping gének). A génexpresszió meghatározására gyakran ilyen belső Referencia géneket választanak, mivel a legtöbb esetben a kezelések hatására a minták egyéb paraméterei is megváltoznak, vagy, mert pontos mérésük igen nehezen kivitelezhető (pl. sejtszám növényi szövetnél).

Az alkalmazott normalizációs módszer nagymértékben befolyásolhatja eredményeink értelmezését. A kísérletes növénybiológiában leggyakrabban használt és elfogadott viszonyítási alap a kinyert nukleinsav összmennyisége, vagy belső Referencia gének mennyisége illetve transzkripciós szintje.

A nukleinsav összmennyiségének pontos meghatározása szükséges ahhoz, hogy azt normalizációhoz használhassuk. Például a genomi DNS mennyisége 260 nm-en spektrofotometriával meghatározva nem ad megfelelően pontos eredményt. Azonban elfogadható nukleinsav mennyiségi mérésnek tekinthető, ha speciális fluoreszcens nukleinsav kötő festékkel mérjük a nukleinsav koncentrációt: pl. a RiboGreen használható mRNS és cDNS jelölésére és fluoreszcens mérésére.

A Referencia gének alkalmazásakor alapvető elvárás, hogy ezek kifejeződését maga a kísérlet, kezelés ne befolyásolja, vagyis transzkripciós szintjük egyforma legyen a minták között. A housekeeping gének rendszerint jó referencia jelöltek, azonban minden kísérlet során igazolni kell, hogy az adott körülmények valóban nem befolyásolják az általunk választott housekeeping gének expressziós stabilitását. Vagyis ugyanúgy meg kell mérnünk expressziójukat a kísérleti mintákban, akárcsak a vizsgált génekét, és meg kell becsüljük stabilitásukat. A referencia gének validálásához különféle algoritmusok állnak rendelkezésünkre, amelyek a Real-Time reakció során kapott nyers adatok alapján expressziós stabilitást számolnak (pl. geNorm és BestKeeper szoftverek). Az is elfogadott eljárás, hogy az irodalmi adatokra támaszkodva kiválasztott legalább 3 belső Referencia gén geometriai átlagát használjuk a vizsgált gén mRNS szintjének normalizálásához.

Fontos hangsúlyozni, hogy a normalizált eredményeink sohasem lehetnek pontosabbak, mint a normalizációhoz használt referencia minősége. Bármilyen változás a referenciában hibaként jelentkezik a végeredményben.

Referencia gén helyett elterjedt a kontroll gén kifejezés is. Ezt semmiképp ne keverjük a Kontroll minta fogalmával (ami helyett használják a referencia minta kifejezést is).

13.1.6. A kísérleti Kontroll és Kalibrátor minta

A kísérlet tervezésénél mindig kell választanunk egy viszonyítási alapot, hogy a kapott gén expressziós eredmények biológiai értelmet nyerjenek. A kérdésfeltevés leggyakoribb módja, hogy a kísérlet során alkalmazott kezelés hatására, milyen eltérést tapasztalunk a normál körülményekhez képest. Vagyis mintáink egy része a „normál” ún. Kontroll körülményeknek felel meg, másik részük pedig a kezelt minták csoportjába tartozik. Azt a mintát, amihez viszonyítunk Kontroll vagy Kalibrátor mintának nevezzük. A Kontroll kifejezés inkább a kísérletben, a Kalibrátor pedig a minta adatelemzésben betöltött szerepére utal.

A normalizációhoz alkalmazott Referencia (gén) és a kalibrációhoz használt Kontroll (minta) fogalma nem keverendő. Az előbbi a reakcióba bemért összes nukleinsav mennyiségét, utóbbi a kísérleti körülmények hatására jelentkező mennyiségi eltéréshez jelent viszonyítási alapot (lásd még: Kiértékelés Δ Δ Ct módszerrel).

13.1.7. Olvadási pont meghatározás

Minden kettős szálú DNS-nek van egy olvadáspontja (Tm), az a hőmérséklet, amin az adott DNS molekulák fele egyszálú formában van jelen a reakcióelegyben. Ez a hőmérséklet függ a DNS szál hosszától, G:C tartalmától, nukleotid sorrendjétől és a helyes Watson-Crick bázispárosodástól. Ha a DNS kettős-szálú DNS-kötő festékkel van jelölve, melegítéskor az olvadáspontot elérve a festék szabaddá válik, ennek megfelelően a fluoreszcencia hirtelen csökken. A fluoreszcenciát a hőmérséklet függvényében ábrázolva egy csökkenő szigmoid görbét kapunk, aminek az inflexiós pontja adja meg az olvadáspontot. Ezt a görbét negatív derivált alakban szokás ábrázolni, ahol az inflexiós pont egyértelmű csúcsként jelentkezik (lásd: 13.5. Ábra.). Egy adott amplikonhoz egy csúcs tartozik. Több csúcs több inflexiós pontot, végeredményben több eltérő amplikont jelez. Precíz detekcióval azonos méretű amplikonok közötti egyetlen bázispár eltérés is kimutatható a szekvenciában. Az olvadási görbe analízisnek alapvetően fontos szerepe van a SYBR Green kémiát használó reakciók specifikusságának ellenőrzésében.

13.5. Ábra. Olvadási görbe Lineáris (A) és negatív derivált (B) ábrázolásban.

13.1.8. Relatív mennyiségi meghatározási módszerek

A mérés alapulhat abszolút vagy relatív mennyiségi meghatározáson. Ha pontosan ismerjük a Kalibrátorként szolgáló minta koncentrációját (vagy azt, hogy hány kópia templát szekvenciát tartalmaz) és ehhez hasonlítjuk a vizsgálni kívánt ismeretlen mintákat, akkor abszolút mérést végzünk. Az abszolút mennyiségi meghatározás megbízhatósága teljes mértékben a standard megbízhatóságán múlik. Abszolút meghatározáshoz a standard minta létrehozása, a pontos koncentráció meghatározása és stabilitása hosszabb tárolás alatt problémát jelenthet. Legtöbbször nem fontos, hogy ismerjük a standard minta kiindulási koncentrációját, és elegendő, hogy megtudjuk a többi kísérleti mintában az adott gén kifejeződése milyen mértékben tér el ettől. Ekkor beszélünk relatív mennyiségi meghatározásról.

13.1.8.1. Standard görbe módszer

Ennek az általánosan használható kiértékelési módszernek hátránya, hogy a Standard görbéhez minden mérés (esszé) alkalmával legalább 15 (5 hígítási tag, mindegyik 3 ismétléssel) plusz reakcióval kell számolni és ez sok esetben jelentősen megnöveli a kísérlet költségeit. A pontos kiértékelés megköveteli, hogy a hígítási sor tagjait együtt mérjük meg az ismeretlen, vizsgálni kívánt mintákkal, ugyanabban a Real-Time esszében. Standard görbét kell készíteni egyrészt a vizsgált GOI-re, másrészt és a Referenciaként kiválasztott génekre is. Minden Standard görbe illesztési pontosságának R2>0,99 kell lennie és a reakció hatékonyságoknak legalább 80%<E<110% közé kell esnie, optimális azonban, ha 90%<E<100%.

A standard görbék egyenlete alapján [(y = ax+b) y = Ct; a = (m) Standard görbe meredeksége; x = log C; b = y tengely metszet] minden mintára meghatározzuk a GOI és Referencia gén(ek) relatív mennyiségét.

A normalizációhoz a GOI relatív mennyiségét vonatkoztatjuk a Referencia gén(ek) relatív mennyiségére, az adott mintán belül, így kapjuk meg a minta normalizált relatív mennyiségét.

Ha van Kontroll/Kalibrátor mintánk, akkor a kezelt minták normalizált relatív mennyiségét ehhez viszonyítjuk.

13.1.8.2. Δ CT módszer

A legegyszerűbb, a Ct értékek közvetlen összehasonlításán alapuló relatív mennyiségi meghatározási módszer. Abból az alapfeltevésből indul ki, hogy ha két minta Ct különbsége 1, akkor a kezdeti templát mennyiségének különbsége kétszeres, a kisebb Ct értékű minta javára. A Ct különbség növekedésével a kezdeti templát szekvencia különbség exponenciálisan nő. A/B = 2Δ Ct, ahol Δ Ct = (CtB-CtA). [Máskép: A/B = 2-Δ Ct, ahol Δ Ct = (CtA-CtB). A nagyobb Ct kisebb templát szekvencia mennyiséget jelent, mint a kisebb Ct. Vigyázz! Ne keverd!] A/B jelentheti ugyanazon amplikon arányát két különböző mintában (például transzgén kópia számának meghatározása) vagy lehet ugyanabban a mintában két eltérő amplikon aránya. Ez utóbbi legtöbbször a GOI és a Referencia gén közötti összehasonlítást jelenti.

Kezdeti feltételek:

  • A vizsgált Ct értékek a reakció dinamikus tartományában vannak.

  • A reakcióhatékonyság közel 100%.

  • Ha két külön amplikont vizsgálunk, mindkettőre feltételezzük a 100%hatékonyságot, vagy a reakciók hatékonyságának különbségét elenyészőnek tekintjük (<4%, Standard görbék meredekségének különbsége <0,1).

A módszer korrekt használatához a kezdeti feltételek bizonyítása szükséges. A kísérletes biológiában rendkívül nehéz közel 100% hatékonyságú reakciókat tervezni, és az optimalizálás sok plusz munkát vesz igénybe, ami a módszer pontosításához és egyéb paraméterek bevonásához vezetett. A reakcióhatékonyság(ok) figyelembevételével a becslés pontossága javítható.

A Δ Ct módszer a gyakorlatban durva becslésre alkalmazható, kis Ct különbségek esetén. A Ct különbségek növekedésével a becslés pontossága rohamosan romlik.

13.1.8.3. Δ Δ Ct módszer

Ugyancsak a Ct értékek direkt összehasonlításán alapuló relatív mennyiségi meghatározási módszer. Alkalmazásához ugyanazokat a kezdeti feltételeket kell bizonyítani, mint a Δ CT módszer esetében! Plusz paraméterként vonjuk be a kísérletben Kontrollként vizsgált minta(ák) Δ Ct értékeit. A számolás során kísérleti mintánként összehasonlítjuk a GOI és a Referencia gén(ek) Ct értékét, majd az így kapott relatív mennyiségi adatokat viszonyítjuk egy Kontroll mintáéhoz. Végeredményként azt az információt kapjuk meg, hogy a GOI milyen arányban van jelen a vizsgált mintákban a Kontroll mintához képest.

A következő négy adattal számolunk: GOI és Referencia gén Ct értékei a Kísérleti mintában (kék), valamint a GOI és a Referencia gén Ct értékei a Kontroll mintában (piros).

Első lépésben a Δ Ct értékeket számoljuk ki mind a kezelt, mind a Kontroll minta esetében. Ez megfelel a normalizációnak.

Második lépésben a vizsgált minta Δ Ct értékéből kivonjuk a Kontroll minta Δ Ct értékét.

Kísérleti mintában lévő normalizált GOImennyisége = 2-Δ Δ Ct

Az összefüggés matematikailag sokféleképpen felírható, de figyeljünk mindig oda, hogy más felírásban mi mit jelent, mit mihez viszonyítunk.

Másképp:

Először minden mintára számolunk Δ Ct értéket a GOIés Referencia reakciók Ct értéke alapján.

Másodszor minden mintára kapott GOI/Referencia relatív mennyiséget elosztjuk a Kontroll mintára kapott relatív GOI/Referencia mennyiséggel

Egyben felírva az összefüggést:

Fontos megjegyezni, hogy ahhoz, hogy a Kísérleti mintában lévő GOI mennyiségét a Kontroll mintában lévő GOI mennyiségéhez kapjuk meg:

Minta / Kontroll → Az osztás a hatványkitevőben ezt jelenti: [Δ Ct Minta – Δ Ct Kontroll]

GOI / Referencia → Ha a hatványkitevőben: (Ct Referencia – Ct GOI) → 2Δ Δ Ct de, ha a hatványkitevőben (Ct GOI- Ct Referencia) → 2-Δ Δ Ct VIGYÁZZ! Ne feledd, hogy a nagyobb Ct kisebb templát szekvencia mennyiséget jelent, mint a kisebb Ct. Nem mindegy, hogy a GOI-et viszonyítod a Referenciához, vagy fordítva, mint ahogy az sem, hogy a Mintát viszonyítod a Kalibrátorhoz vagy fordítva.

13.1.8.4. Pfaffl módszer

A Δ Δ Ct módszer tovább finomítható, ha figyelembe vesszük a GOI és a Referencia reakciók hatékonyságát. Pfaffl gyakorlatilag úgy alakította át a Δ Δ Ct módszert, hogy a hatványalapban 2 helyett a GOI és a Referencia reakciók hatékonyságával lehessen számolni. (Ha ugyanazokkal a Ct értékekkel dolgozunk és mindkét reakció hatékonyságát 2-nek vesszük, ugyanazt az eredményt adja, mint a Δ Δ Ct módszer.) Feltételezi, hogy minden minta Ct értéke a reakciók dinamikus tartományában van és ismerjük a reakcióhatékonyságokat (E).

Először minden minta Ct értékét a Kontroll minta Ct értékéhez hasonlítjuk, külön a GOI és külön a Referencia reakciók esetében.

Másodszor minden minta relatív GOI mennyiségét elosztjuk a relatív Referencia mennyiségével. (Ez felel meg a normalizációnak.):

Kísérleti mintában lévő normalizált GOI mennyisége: