13.2. Példafeladatok

Két példát mutatunk be arra, hogyan alkalmazhatjuk a Q-PCR módszert a növényi molekuláris biológiában. Az első példa genomi DNS templát felhasználásával transzgén kópia számának meghatározása, míg a második egy génexpressziós vagyis mRNS mennyiség mérésére szolgáló vizsgálat. A példák mindkét esetben egy-egy nagyobb kísérletsorozatból kiragadott részletek, amiket megpróbálunk önállóan értelmezni. A Q-PCR korrekt kivitelezéséhez és kiértékeléséhez optimalizációra és előkíséreltekre van szükség, melyek itt most csak említés szintjén szerepelnek.

Mindkét példában a (Thermo Scientific) Maxima SYBR Green Master Mix-et és az (Applied Biosystems) StepOnePlus™ és ABI Prism 7000™ Real-Time PCR készülékeket használjuk. A bemutatott ábrák a készülékekhez tartozó szoftverek képanyagának felhasználásával készültek.

13.2.1. Előkíséreltek

Ha olyan gének mennyiségét vagy expresszióját akarjuk mérni, amiket előttünk már mások is vizsgáltak, a szakirodalom jó forrása lehet a már beállított reakcióknak. Szerencsés esetben valamely biotechnológiai cég forgalmaz optimalizált, kész reakciókat.

A kísérletes munka során gyakran találkozunk azzal a problémával, hogy az általunk vizsgálandó gén mennyiségét vagy expresszióját mi szeretnénk meghatározni először. Ilyen esetekben nekünk kell kísérleti reakciót tervezni, és azt beállítani.

Primer tervezés: SYBR Green kémiát alkalmazó reakcióknál az amplikon optimális mérete 50 – 150 bp. Génexpressziós vizsgálatokhoz úgy tervezzük a primereket, hogy csak cDNS-en működjön a reakció, genomi DNS-en ne (pl. az egyik primert exon-exon határra).

A reakciókat optimalizálni kell hagyományos PCR-el: Egyetlen, nagyon erős sávot kell kapnunk agaróz gélen. Főbb optimalizálandó paraméterek: kapcsolási hőmérséklet, primer arányok, Mg2+ koncentráció. Ha a Master Mix-et mi mérjük össze, akkor annak összetételét is optimalizálni kell: Taq polimeráz, puffer, SYBR Green, ROX, PCR adalék (pl. DMSO, Glycerol) stb.

A hagyományos PCR-ben kiválóan működő reakciót Real-Time vizsgálatban ellenőrizzük tovább, rendszerint hígítási sor futtatásával. Főbb vizsgálati szempontok:

Olvadási görbe, dinamikus tartomány és reakcióhatékonyság.

Belső referencia gének validálása a kísérleti beállításhoz, szövethez stb. (lásd: II. példafeladat.)

Kísérleti minták előzetes vizsgálata, és a megfelelő hígítás kiválasztása: A mintákat olyan hígításban kell alkalmazni, hogy azok biztosan a reakció dinamikus tartományába essenek.

13.2.3. I. Példafeladat

Transzgén homo/hemizigóta állapotának meghatározása

Szövetspecifikus genetikai szabályozóelemek vizsgálatához olyan transzgenikus árpa növényeket hoztunk létre, melyek a transzgént, az uidA gént csak a szemtermésükben expresszálják. Az uidA gén a Gus (β-Glükuronidáz) enzimet kódolja. A Gus enzim a megfelelő szubsztrátot jól látható kék termékké alakítja, ezért azok a szövetek, ahol a Gus enzim aktív kéken festődnek. A Gus enzim mennyiségét nagymértékben befolyásolja, hogy az adott transzgenikus növény hány kópiában tartalmazza a transzgént. A Q-PCR vizsgálat célja annak megállapítása, hogy a transzgén hemizigóta (olyan heterozigóta, aminél az adott lókusznak nincs megfelelője a homológ kromoszómapáron) vagy homozigóta formában van-e jelen.

Mivel kis különbségeket (2X – homozigóta:hemizigóta – 2:1) kell kimutatni nincs szükség nagy dinamikus tartományra. A bemutatott példa reakciót úgy állítottuk össze, hogy többféle kiértékelés is lehetséges legyen: Standardgörbe; Δ Ct, Δ Δ Ct módszer, Paffl módszer.

Mivel az ilyen típusú Real-Time vizsgálat genomi DNS felhasználásával történik, a normalizációhoz elég egy genomi Referencia gén. (A génexpressziós kísérletektől eltérően, ebben az esetben nem kell tartanunk a Referencia gén mennyiségbeli változásától.) A vizsgált templát szekvenciák száma így összesen kettő: transzgén (GOI) és Referencia gén. A GOI a Gus enzim génjének 125 bp, míg a Referencia egy Bzip transzkripciós faktor génjének 142 bp hosszú szakasza. Összesen 10 különböző növény DNS mintáját vizsgáljuk meg, melyek egy a transzgénre hemizigóta növény utódai (Minta 1-10). (Az előzetes PCR eredmények alapján a transzgént nem tartalmazó utódokat nem vizsgáljuk Q-PCR-el.) A Minta 1 olyan növénytől származik, amiről már tudjuk, hogy a transzgént egy példányban, homozigóta állapotban tartalmazza (Kalibrátor minta). A többi minta esetében azt akarjuk megtudni, hogy a transzgén homozigóta vagy hemizigóta formában van-e a genomban.

A minták DNS koncentrációját 260 nm-en UV spektroszkópiával határozzuk meg. Ez a mérés normalizációhoz nem alkalmas, de ahhoz igen, hogy a bemért templát DNS mennyisége ne legyen nagyon eltérő a különböző minták között.

Ahhoz, hogy a reakciók alapparamétereit meghatározzuk és Standard görbe módszerrel értékelhessük eredményeinket, hígítási sort készítünk, melyhez a Minta1-et használjuk. A legtöményebb hígítási tag 10 ng genomi DNS-t tartalmaz, majd kétszeres hígításonként összesen 6 tagot (10ng; 5 ng; 2,5 ng; 1,25ng; 0,625ng; 0,3125 ng). A 9 vizsgálandó mintából 2-2 ng-ot mérünk minden reakcióba.

A kezdeti beállításokból következően arra számíthatunk, hogy az amplifikációs görbék közel lesznek egymáshoz és a Ct értékek egy szűk tartományba esnek.

A reakciót összesen 96 mintára kell összeállítani:

6 tagú hígítási sor (Minta 1 hígításaiból)

9 ismeretlen minta (Minta 2 – Minta 10)

1 NTC (DNS minta helyett, vizet tartalmazó Non-Template Control)

Mindent 3× technikai ismétlésben (az alapvető elvárás az eredmények értékeléséhez)

Mindezt kétszer (a GOI és Referencia a szekvenciára)

(6+9+1=16) ×3×2 = 96

Így egy teljes 96 zsebet tartalmazó plate-et kihasználunk. (lásd: 13.6. Ábra.)

Reakciókomponensek:

Gyári Master Mix (MM):

  • 2× töménységű PCR puffer

  • Hot Start Taq DNS polimeráz

  • dNTP (0,5 mM)

  • Mg2+ (0,5 – 4 mM)

  • SYBR Green

  • ROX (100 nM)

Ehhez kell hozzáadni a

  • templát DNS-t

  • primereket (0,5 – 4 μM)

  • és megfelelően beállítani tisztított, desztillált vízzel

Általános reakciókra optimalizált Master Mixet több cég is forgalmaz. Megfontolandó a készülékhez optimalizált Maser Mix használata, de nem kötelező. Szükség esetén mi is összemérhetjük a reakcióelegyet a felsorolt komponensekből, ilyenkor lehetőségünk van a leginkább megfelelő enzim kiválasztására, és az ahhoz tartozó puffer optimlizálására.

Az előzetes optimalizálás során megállapítottuk, hogy a Bzip (Referencia) génre tervezett reakció 1 μM primer koncentráció, míg az uidA gén (GOI) kimutatására szolgáló PCR 2 μM primer koncentráció mellett működött a leghatékonyabban. Az egyszerűség kedvéért a két különböző reakcióhoz tartozó primerpárból olyan hígításokat készítünk, hogy belőlük ugyan akkora térfogatokat kelljen a reakcióelegyekbe bemérni, és az összetartozó Forward és Reverse primereket egy csőben hígítottuk az adott koncentrációra.

13.2.3.1. Az esszé összemérése

Egy reakcióra számolva az összetevők:

12,5 μl MM

2,5 μl Forward és Reverse Primer keverék

7,5 μl H2O

2,5 μl Templát

Σ 25 μl végtérfogat

A leghatékonyabb pipettázási stratégia és a minták keresztszennyezésének elkerülése végett a következő lépésekben hajtjuk végre az esszé összemérését:

1) A GOI kimutatására tervezett reakcióhoz készítünk egy Super Mix-et (SM), mely tartalmazza a Master Mix-et, a GOI-re specifikus primerpárt és vizet, de a templát DNS-t nem. Összesen 48 reakcióra 10 % ráméréssel számolunk, a pipettázásból eredő túlmérés ellensúlyozására.

SM: 48 × 1,1=52,8

12,5 × 52,8 = 660 μl MM

2,5 × 52,8 = 132 μl Primer

7,5 × 52,8 =396 μl H2O

2) 0,5 ml-es Eppendorf csövekbe szétosztunk a 9 ismeretlen mintából és a hígítási sor 6 tagjából 8-8 µl templát DNS-t, törekedve a maximális precizitásra. A negatív Kontrollhoz egy csőbe 8 µl steril desztillált vizet mérünk be. A GOI reakcióhoz így összesen 16 csőben egyenként 8 µl mintával rendelkezünk.

3) A SM-ből 72 µl-t mérünk minden egyes előkészített mintához, így összesen 80 µl reakcióelegyet kapunk. Ez a 80 μl felel meg az egy mintához tartozó három technikai ismétlés összegének, 5μl ráméréssel számolva.

A Referencia génre tervezett reakcióhoz a fent leírtaknak megfelelően megismételjük az 1-3 lépéseket az arra specifikus primerek bemérésével.

4) Utolsó lépés a Real-Time PCR-hez gyártott speciális plate-re való szétosztás. A plate-et a csomagolásából való kivétel után az erre a célra gyártott plate-tartóban érdemes elhelyezni. A plate minden egyes zsebébe 25 µl-enként bemérjük a 3-3 technikai ismétlésnek megfelelő végtérfogatot. A reakció szétosztása után a plate-t optikai fóliával kell lezárni. Ennél a lépésnél fontos, hogy a záródás tökéletes legyen (különösen a széleknél), valamint a fóliának és a plate zsebeinek kívülről is szennyeződésmentesnek kell maradnia (pl. zsír a kezünkről, púder a kesztyűről ilyen szennyeződésnek számítanak). A lezárt plate-t centrifugáljuk (3000 rpm, 3 min), hogy a reakcióelegyek a zsebek alján összegyűljenek.

Megjegyzés: A reakcióelegy összetevőit, ill. az elegyeket szétosztás előtti alaposan össze kell keverni (vortex). A pipettázás pontosságára különös figyelmet kell fordítani. Ha nem rendelkezünk kizárólagosan csak a Real-Time PCR összemérésre fenntartott laborral és pipetta sorozattal szűrős pipettahegy használata határozottan ajánlott.

13.2.3.2. A Real-Time készülék beállítása

Ez mindig az adott készüléktől és szoftvertől függ. Az I Példafeladatban az Applied Biosystems StepOne™ Plus Real-Time készüléket és a StepOne™ v.2.2.2 szoftvert használjuk.

1) Plate setup:

Rendszerint szükséges a minták pozíciójának és az alkalmazott fluoreszcens festék típusának megadása. Ha használunk hígítási sort, akkor a hígítási sor egyes tagjainak, az ismeretlen és a Kontroll mintáknak a megnevezése, a minták pozícióinak megadása a plate-en szintén szükséges. (lásd: 13.6. Ábra.)

13.6. Ábra: Plate Setup A plate bal felében a GOI-re (Gus), jobb felében a Referenciára (Bzip) összeállított reakciók vannak. Az egy mintához tartozó háromszoros technikai ismétlések egymás mellett helyezkednek el (pl.: A1, A2, A3). Az S a Standard sorozat, az U az ismeretlen, N az NTC reakciókat jelölik.

2) Hőmérséklet és időprofil meghatározása:

A Hot Start Taq polimeráz aktiválásához 5-15 perc kezdeti denaturációt kell beállítani a gyártó által megadottak szerint. A ciklusos denaturáció 95°C 20 másodperc. [A primer kapcsolódását és a lánchosszabbítást gyakran egy lépésként kezelik. Ezt magas primer kapcsolódási hőmérsékletnél Tm > 60°c és rövid amplikon méretnél (<150 bp) célravezető. Ilyenkor a kapcsolódási hőmérsékleten tartják a reakciót 40-60 másodpercig.]

A bemutatott példában a reakcióhoz mi külön kapcsolódási (59 °C 30 s) és lánchosszabbítási (72°C 20 s) lépést alkalmazunk. Nagyon fontos, hogy SYBR Green kémiát használva a lánchosszabbítási lépés végére állítsuk a detekciót idejét a készülékben. Ez a készüléktől függően több-kevesebb időbe telik és hozzá kell számolnunk a lánchosszabbítási lépés idejéhez. A rendszerint 40 ciklusos amplifikáció után a keletkezett amplikonok olvadáspontjának analízise, vagyis a disszociációs protokoll használata javasolt. Így tudjuk ellenőrizni a reakció specifikusságát és az esetleges szennyezéseket. (lásd: 13.7. Ábra.)

13.7. Ábra. Hőmérséklet és idő profil, és disszociációs protokoll

13.2.3.3. Kiértékelés

A mai modern készülékek és szoftverek a reakció futása alatt kirajzolják a plate egyes zsebeihez tartozó amplifikációs görbéket, így lehetővé teszik a reakciók valós idejű követését. A mennyiségi kiértékelés azonban csak a teljesen lezajlott reakció után, a különböző kalibrációs értékek figyelembevétele és kiértékelési beállítások megadása után végezhető el. A reakció során a készülék minden zsebből megfelelő időközönként begyűjti a fluoreszcens adatokat, ezeket a reakció egyéb megadott paramétereivel együtt egyetlen file-ban tárolja. A kiértékeléshez ezeket az adatokat használjuk.

1) Tekintsük át, hogy minden zsebben volt-e megfelelő amplifikáció, valamint, hogy az amplifikációs görbék megfelelő lefutásúak-e. Ellenőrizzük, hogy a negatív Kontroll mutat-e amplifikációt. Ha nem, akkor rendben van, az NTC-vel nincs további teendőnk, ha azonban kaptunk amplikációt akkor valamilyen szennyeződésre kell gyanakodnunk.

Ellenőrizzük a disszociációs protokoll alapján kapott olvadási görbéket. Valóban csak azt az egy terméket kaptuk, amit az optimalizálássorán már láttunk. Ha több csúcsot kaptunk vagy a görbének válla van, az amplifikáció értelmezhetetlen, nincs további értékelésnek értelme. Ha az NTC-ben volt amplifikáció, nézzük meg, hogy az olvadáspont az amplikonunkra jellemző-e. Ha reakcióspecifikus terméket kaptunk, akkor a plate zsebeinek kereszt szennyeződése valószínűsíthető, ennek elkerülése érdekében a pipettázási technikánkat kell finomítani. Ha a termék nem reakció specifikus, akkor a reakció elegy összetevőinek egyéb külső szennyeződésére kell gyanakodnunk, ezeket ellenőrizni vagy a reakció komponenseket érdemes újakra cserélni. A 13.8B ábrán jól látható, hogy a GOI-nél a 3 NTC-ből 2-nél kaptunk specifikus amplifikációt. Ct értékük megközelítőleg 35, ami 7 ciklussal több, mint a leghígabb kísérleti minta, vagyis a szennyeződés mértéke elenyésző, nem jelent gondot a kiértékelés során.

13.8. Ábra: Olvadási görbék: A: Referencia reakciók olvadási görbéi; B: a Referencia és GOI olvadási görbéi együtt láthatóak. A GOI-hez tartozó görbéknél megfigyelhető két alacsonyabb csúcs a 3 NTC reakcióból 2-ben jelez kis mennyiségű, specifikus amplifikációt.

2) Az alapvonal beállítása

Az alapvonalat kezdeti és végső ciklusszámmal határozzuk meg. Kezdeti ciklusszámot általában 1-6-ig szokás állítani. (A mintákban lehetnek fluoreszcensen aktív fehérjék, amik az első néhány denaturációs lépésben elvesztik a fluoreszcenciájukat. Ha azt tapasztaljuk, hogy az első ciklusokban magasabb a fluoresszencia, mint a későbbiekben, akkor érdemes magasabb kezdeti ciklusszámot választani.) Az alapvonal végső ciklusszáma, mindig legyen kisebb, mint a legkorábbi görbe, legelső már szemmel láthatóan alapvonalból kiugró pontja. Vannak szoftverek melyeknél az egyes mintákra külön is beállítható az alapvonal, de sokszor elég, ha egy adott esszéhez egy közös alapvonalat választunk. Korrekt alapvonal beállítás után szabályos, szigmoid lefutású görbéket kell kapnunk.

A példa reakcióban 1 és 16 ciklus közé állítottuk az alapvonalat, egységesen az egész plate-re. A nagy koncentrációjú mintákhoz tartozó amplifikációs görbéknél az első alapvonalból kiugró pont a 18. ciklusnál, míg az alacsony koncentrációhoz tartozó amplifikációs görbéknél a 24. ciklusnál vannak. Ezután lineáris és logaritmikus nézetben is ellenőrizzük, hogy a technikai ismétlések görbéi mennyire esnek egybe. Ha a háromszoros technikai ismétlések között találunk nagyon eltérő görbéket, azokat ki kell hagyjuk a további elemzésből.

2) Küszöbérték beállítása

A küszöbértéknek minden mintánál az exponenciális fázisba kell esnie, vagyis logaritmikus nézetben a lineáris szakaszok egyértelműen párhuzamos részére illesztjük a küszöböt. A küszöbérték változtatásával megkeressük a technikai ismétlések közötti legkisebb szórás értékeket (> 0.1 Ct, kevesebb mint 10%), ez segít elkerülni, hogy a küszöbértéket az exponenciális fázison kívülre helyezzük. Ha egyes mintáknál a technikai szórás kiugróan magas, akkor valószínűleg van közöttük „hibás reakció”. Ezeket vonjuk ki a további elemzésből. (A hiba eredhet a plate zsebeinek szennyeződéséből, ha nem voltunk elég elővigyázatosak az összemérésnél. Előfordul az is, hogy a készülékbe kerül szennyeződés.)

3) Mennyiségi meghatározás Standard görbe alapján

A fenti beállításokkal készítsük el a Standard görbét, figyelembe véve az egyenes illesztés pontosságát (R2>0,99) és kizárva az esetlegesen kieső pontokat (lásd: 13.11. Ábra). A Standard görbe alapján megkapjuk a reakció hatékonyságát is, ami 80% és 110% között elfogadható. Az aktuális kísérleti reakció hatékonysága kis mértékben ingadozhat az optimalizálás során kapott érték körül (5%), ha attól nagyon eltérő, akkor meg kell ismételni az esszét.

Az I. példafeladatban mind a GOI-re, mind a Referencia génre tervezett reakció esetében ki kell zárnunk a legtöményebb hígítási tagot a további számításokból, mert nem illeszkedik jól a többi pont által meghatározott egyenesre. A GOI leghígabb hígítási tagjához tartozó technikai ismétlésből az egyiket szintén ki kell hagyjuk, mert Ct értéke jelentősen eltér a két másik ismétléstől.

13.9. Ábra. A GOI-hez tartozó hat eltérő koncentrációjú hígítási tag (különböző színnel) amplifikációs görbéi logaritmikus nézetben. A legtöményebb minta (piros) és a leghígabb (sötétkék) minta egyik technikai ismétlése szemmel láthatóan nem követi egymást szabályosan – a Standard görbét lásd a 13.10. Ábrán.

13.10. Ábra. Standard görbe a hattagú hígítási sor alapján. Pirossal bekarikázva az egyenesre nem illeszkedő pontok láthatóak (lásd még 13.9. Ábra). Bár az egyenes illesztés pontossága (R2>0,99) elfogadható, ezen pontok elhagyása után lényegesen javul – lásd: 13.11. Ábra.

13.11. Ábra. Standard görbék a Gus (Piros) és Bzip (Kék) reakciók alapján. A reakció hatékonyság a GOI-re 84,6% és a Referenciára 87%

A fenti beállítások után a Real-Time készülékhez tartozó szoftverek elvégzik az esszé analízisét és megkapjuk az egyes kísérleti minták Ct értékeit és a hígítási sorhoz viszonyított relatív mennyiségüket (13.3. és 13.4. táblázat). A Ct értékeknek a reakció dinamikus tartományába kell esnie. Ha egy minta Ct értéke a Standard sor tagjainak Ct értékein kívülre esik, azt fenntartással kell kezelnünk, vagy el kell hagynunk.

A Real-Time szoftverek biztosítják a lehetőségét, hogy adatainkat az elemzés különböző fázisaiban importáljuk MS-Excel táblázatba. Ezek lehetnek a nyers fluoreszcens adatok, az alapvonal és küszöbérték beállítás utáni Ct értékek, vagy akár a standard görbe alapján számolt relatív mennyiségek is. A nyers adatok exportálása lehetőséget ad arra, hogy különböző szoftverekkel kiegészítsük a kiértékelést. A LinReg szoftver pl. képes minden egyes reakcióra külön-külön reakcióhatékonyságot becsülni. Az egyes minták egyedi reakcióhatékonyságát azért érdemes ellenőrizni, mert ennek segítségével megtalálhatóak az esetlegesen rosszul előkészített cDNS minták, és a bemérési és/vagy detektálási hibával terhelt reakciók (lásd LinReg szoftver). Továbbá használható kiértékelésre is, ekkor az összes egyedi reakcióhatékonyságot átlagolva, hígítási sor nélkül tudunk reakcióhatékonyságot becsülni (lásd: 13.4. Ábra.). Továbbá ez alapján és a küszöbérték beállítása után a szoftver képes Ct értékeket és a kiindulási cDNS mennyiséget (N0) is meghatározni.

13.1. – 13.4. Táblázatokban az alapvonal és küszöbérték, valamint a fentebb említett reakciók kizárása után kapott Ct értékek láthatóak. A színjelzések a további kiértékelésekhez tartozó magyarázatok könnyebb megértését hivatottak segíteni.

13.1. Táblázat. Hígítási sor a Referencia szekvenciára (Bzip)

13.2. Táblázat. Hígítási sor a GOI-re (transzgén – Gus).

13.3. Táblázat. A 2-10 minták Ct értékei a Referencia szekvenciára (Bzip)

13.4. Táblázat. A 2-10 minták Ct értékei a GOI-re (Gus)

A mintákban lévő GOI és Referencia Relatív Mennyiségét a Standard görbék egyenlete alapján számoljuk ki, és értékeik az 13.1. – 13.4. Táblázatok utolsó oszlopaiban szerepelnek. A normalizációhoz egy adott minta esetében a GOI mennyiségi (R.Mennyiség) értékét kell osztani a Referencia értékkel. [Normalizált GOI = GOIl/Ref.] Pl: G1/G7 (lásd 13.3. és 13.4 Táblázat.)

13.5. Táblázat.

A végső kiértékeléshez fel kell használnunk a Kalibrátor mintát, amihez a többi ismeretlen mintát viszonyítjuk. Ez esetben a Minta 1 a Kalibrátor minta, amiből a hígítási sort is készítettük. A Minta 1-ről tudjuk, hogy az uidA transzgénre nézve homozigóta, így ennek a mintának a relatív mennyiségét 1-nek vesszük. Ekkor a 0,5 érték képviseli a hemizigóta mintákat. Mivel tudjuk, hogy 1-et vagy 0,5-öt kaphatunk, a feladat kiértékeléséhez szükséges becslés így biztonsággal elvégezhetjük.

Az egyes mintákra mért átlageredmények alapján a Minta 2 és 3 esetében a várttól több mint 10%-ban eltérő eredményeket kaptunk, ezért a becslés nem teljesen megbízható esetükben. Az eredmények alapján a mintákról megállapítható, hogy hemizigóták (3-as, 6-os, 8-as, 9-es és 10-es minták), avagy homozigóták a transzgénre nézve (2-es, 4-es, 5-ös, 7-es minták).

4) Mennyiségi meghatározás a Δ Ct módszerrel

A GOI és Referencia reakciók paraméterei miatt a módszer nem teljesen korrekten alkalmazható ennek az esszének az elemzéséhez, mert a reakciók hatékonysága viszonylag alacsony. Mivel azonban a hatékonyságok kevéssé térnek el egymástól, a kis Ct különbségek lehetővé teszik, hogy durva becslésre használjuk.

Ha Δ Ct = CtReferencia– CtGOI → 2Δ Ct = GOI/Referencia (vagy: ha Δ Ct = CtGOI – CtReferencia → 2-Δ Ct = GOI/Referencia)

13.6. Táblázat.

Ennél a kiértékelésnél azt kapjuk meg, hogy egy mintán belül mennyi a GOI mennyisége a Referencia mennyiségéhez képest. A mi esetünkben a Referencia (Bzip) egy homozigóta gén, vagyis mennyiségét 1-nek véve a homozigóta mintáknál is 1-et kell kapjunk, míg 0,5-öt a hemizigóta minták esetében. A Minta 1 homozigóta a GOI-re, így elméletileg ennél a mintánál közel azonos Ct-t kellett volna kapnunk a GOI-re és a Referenciára. Azonban kb. fél ciklus eltérést tapasztaltunk minden hígításnál a Referencia javára, amely eltérés valószínűleg a két reakció eltérő hatékonyságából ered. A fél ciklus eltérést és azt figyelembe véve, hogy így következetesen túlbecsüljük a relatív mennyiségeket, ebben a kísérletben még így is használható a homo és hemizigóták megkülönböztetésére. Végeredményként az Standard görbe módszerrel megegyező eredményeket kapunk: a 3-as, 6-os, 8-as, 9-es és 10-es minták hemizigóták, a 2-es, 4-es, 5-ös, 7-es minták a homozigóták a transzgénre nézve.

A Referencia és GOI közötti nagyobb Ct eltérések esetén az eredmények torzulása miatt az esszé nem lenne értékelhető. Így ezeknél az amplikonoknál a kétszeresnél sokkal nagyobb különbségek kimutatására ez a módszer nem lenne alkalmazható.

5) Értékelés Δ Δ Ct módszerrel

A GOI és Referencia reakciók paraméterei miatt a módszer nem teljesen korrekten alkalmazható ennek az esszének az elemzéséhez, a reakciók viszonylag alacsony hatékonysága miatt. Mivel azonban a hatékonyságok kevéssé térnek el egymástól, a kis Ct különbségek lehetővé teszik a Δ Δ Ct módszer használatát anélkül, hogy az eredmények érzékelhetően torzulnának. (lásd: Δ Δ Ct módszer). Az egyszerűség kedvéért induljunk ki az előző Δ Ct kiértékelésből (13.6. Táblázat). Emeljük ki a Minta 1–et, mint Kalibrátor mintát: A Δ Ct módszerrel átlag 1,42 relatív GOI mennyiséget kaptunk. Minden az adott mintához tartozó relatív GOI mennyiséget, osszunk el ezzel az értékkel pl.: [Minta 2 GOI/Ref = 1,01 (kék)] / [Minta 1 Átlag = 1,42 (piros)] = [Minta 2 2Δ Δ Ct = 0,71 (zöld)]. (Ez hasonló a Standard görbe módszer utolsó lépéséhez, ahol a normalizált GOI mennyiségeket viszonyítottuk a Kalibrátor minta mennyiségéhez, [ami ott 1 volt, itt 1,42].)

13.7. Táblázat.

Ez a módszer ugyancsak becslésre használható, de az eredményekből is látszik, hogy jóval pontosabb, mint a Δ Ct önmagában. A relatív GOI mennyiségekre kapott értékek nem térnek el jelentősen attól, amit a Standard görbe módszerrel kaptunk. Ez alapján a további kísérletekben nem lenne szükség Standard görbére, elég lenne a Kalibrátor minta az egyes újabb esszék kiértékeléséhez. Az egyes esszék közötti esetleges reakció hatékonyságbeli eltéréseket is figyelembe tudnánk venni a Kalibrátor minta segítségével.

Megjegyzendő ennél a kiértékelésnél is, hogy nagyobb Ct különbségek esetén a reakciók viszonylag alacsony hatékonysága miatt az eredmények megbízhatatlanná válnának.

6) Értékelés Paffl módszerrel

A reakcióhatékonyságok ismeretét feltételezi.

A Δ Δ Ct logikáját (először normalizáció, majd Kalibrátor mintához viszonyítás) megfordítva, felhasználhatjuk a reakciók hatékonyságát is a számolás során: Először minden mintát a Kalibrátor mintához viszonyítunk, majd az így kapott relatív mennyiségeket normalizáljuk.

(Lásd: 13.2. és 13.4. (kék) 13.1. és 13.3. (zöld) majd 13.8. Táblázatok)

13.8. Táblázat.

Mivel a hatékonyságok a GOI és Referencia reakciónál minimálisan tértek el, valamint kis Ct különbségekkel kellett számolnunk, az eredmények nem térnek el lényegesen attól, amit a Δ Δ Ct módszerrel kapunk.

Bár a különböző kiértékelési módszerekkel nagyon hasonló eredményeket kapunk, a reakciók paraméterei miatt (alacsony hatékonyság) a Standard görbe és a Pfaffl módszert lehetne fenntartások nélkül használni.

13.2.4. II. Példafeladat

Génexpresszió mérése relatív mennyiségi meghatározással

A génexpressziós vizsgálatok a GOI transzkripciós aktivitásának kimutatására szolgálnak. Tulajdonképpen a GOI-ről átíródó mRNS-ek mennyiségét határozzuk meg Real-Time PCR módszerrel. Ehhez szükség van a minták összes mRNS-ének kinyerésére. A PCR reakcióhoz ezekről ún. kópia vagy cDNS-t készítünk, mivel PCR templátként csak DNS molekulák alkalmasak.

A II. példában egy a fotoszintetikus apparátus felépítésében részt vevő antennafehérje génjének, az Lhcb5 génnek transzkripcióját vizsgáltjuk Cd-stressz hatása alatt. A fotoszintetikus apparátus antenna fehérjéinek nemcsak a fénygyűjtésben, hanem a változó környezeti körülményekhez való alkalmazkodásban, ebből eredően a stressz alatt kialakuló növényi válaszban is igen fontos szerepük van. Vizsgálati modellnövényünk a nyárfa (Populus sp) nemzetségbe tartozik, a nemzetség több fajának genomi és mRNS szekvenciája hozzáférhető különböző adatbázisokban. A Real-Time PCR reakciók tervezését megkönnyíti, hogy az Lhc-család fehérjéinek genetikai kódját a sejtmag és nem a kloroplasztisz tartalmazza. A fotoszisztéma II kapcsoló antennáját alkotó Lhcb5 transzkripciójának analízise egy a teljes Lhc fehérje család génexpresszió szintjét vizsgáló kísérletsorozatból kiragadott példa.

Összesen 5 kezelt és 5 kezeletlen mintában határozzuk meg az Lhcb5 (GOI) relatív expresszióját. Eltérő számozás különbözteti meg a kezelés kezdetén már kifejlett, alsó (-2) és a kezelés alatt fejlődő, felső (+2) leveleket. Az alsó (-2) levelek esetében a kezelés kezdetétől számított 2. és 7. napon vettünk mintát mind a Kontroll, mind a Cd-kezelt növényekből. A kezelés megkezdését követően fejlődött, felső (+2) levelekből három időpontban vettünk mintát, a kezelés kezdetétől eltelt 4., 7. és 14. napon. A levélmintákból mRNS-t tisztítottunk, majd átírtuk cDNS-re.

Példa a minták elnevezésére: 7n Ko-2 = hétnapos Kontroll, alsó levél

7n Cd+2 = hétnapos Cd-kezelt, felső levél

A relatív mennyiségi meghatározás alapját Standard görbe segítségével végezzük. Kiválasztottunk a Kontroll minták közül egy Kalibrátort, amely mintából hígítás sorozatot készítettünk: 100×, 200×, 400×, 800×, 1600× és 3200× hígításokkal.

Két eltérő normalizációt hasonlítunk össze a mérés során. Egy elő kísérlet során validálást végeztünk 6 különböző, belső Referenciaként használatos house-keeping génre. Real-Time reakcióban megmértük transzkripciójukat a kísérleti mintákban, majd a geNorm szoftver segítségével megállapítottuk transzkripciós stabilitásukat a minták között. Ezután kiválasztottunk 3 belső Referencia gént, név szerint az elongációs faktor- (ef1-), protein-phosphatase-2a (pp2a) és az ubiquitin-conjugating enzime 10 (ubc10) génjét, amelyek kifejeződésének geometriai átlagát, mint normalizációs faktort, használtuk a GOI transzkripciójának mérésére (13.9. táblázat).

Másik normalizációs módszerünk a kísérleti mintákból kinyert összes cDNS mennyiségének meghatározásán alapul. Ehhez a méréshez az egyszálú RNS-hez, valamint cDNS-hez kötődő fluoreszcens RiboGreen festéket használtuk. Előzetesen optimalizált körülmények között a festékmolekulák mennyisége egyenesen arányos a nukleinsav mennyiséggel. A minták normalizálásához a RiboGreen fluoreszcencia hozamát használtuk faktorként (13.9. táblázat).

13.9. Táblázat.

13.2.4.1. Az esszé összemérése

Egy reakcióra számolva az összetevők:

12,5 μl MM

2,5 μl Forward és Reverse Primer keverék

7,5 μl H2O

2,5 μl Templát

Σ 25 μl végtérfogat

1) Az I. példafeladatban bemutatott vegyszerekkel és módszerrel mérjük össze a reakciót a Lhcb5 cDNS-re specifikus primerpárral (primer végkoncentrációja a reakcióban 1 μM primerenként). A Super Mix tartalmazza a Master Mix-et, a GOI-re specifikus primerpárt és vizet, de a templát cDNS-t nem. Összesen 51 reakcióra számolunk,

6 tagú standard sor, 10 minta és az NTC, 3-szoros technikai ismétlésben:

17X3 = 51 (+10% = 56)

10 % ráméréssel számolva, a következő mennyiségeket mérjük össze.

Super Mix: 51×1,1=56

12,5 × 56= 700 μl MM

2,5 × 56= 140 μl Primer

7,5 × 56= 420 μl H2O

2) 0,5 ml-es Eppendorf csövekbe szétosztunk a 10 ismeretlen mintából és a hígítási sor 6 tagjából 8-8 µl templát cDNS-t. A negatív Kontrollhoz egy csőbe 8 µl steril desztillált vizet mérünk be.

3) A SM-ből 72 µl-t mérünk minden egyes előkészített mintához, így összesen 80 µl reakcióelegyet kapunk. Ez a 80 μl felel meg az egy mintához tartozó három technikai ismétlés összegének, 5μl ráméréssel számolva.

4) Utolsó lépésünk a Real-Time PCR-hez gyártott speciális plate-re való szétosztás. A plate minden egyes zsebébe 25 µl-enként bemérjük a 3-3 technikai ismétlésnek megfelelő végtérfogatot. A reakció szétosztása után a plate-t optikai fóliával lezárjuk, majd röviden centrifugáljuk (3000 rpm, 3 min).

Megjegyzés: A reakcióelegy összetevőit, ill. az elegyeket szétosztás előtti alaposan össze kell keverni (vortex). A pipettázás pontosságára különös figyelmet kell fordítani. Ha nem rendelkezünk kizárólagosan csak a Real-Time PCR összemérésre fenntartott laborral és pipetta sorozattal, a szűrős pipettahegy használat határozottan ajánlott.

13.2.4.2. A Real-Time készülék beállítása

Ehhez a Real-Time reakcióhoz az Applied Biosystem ABI Prism 7000 Real-Time készüléket és az ABI Prism 7000 SDS szoftvert használtuk.

13.12. Ábra. Plate setup Mintánként a háromszoros technikai ismétlések egymás mellett helyezkednek el (pl. B1, B2, B3 a 7n Ko-2 minta 100-szoros hígítását tartalmazza). S jelöli a Standard sorozat tagjait, U (unknown) az ismeretlen mintákat, N pedig a templát nélküli NTC reakciókat.

13.13. Ábra. Hőmérséklet és időprofil meghatározása A PCR reakció során a kapcsolási és lánchosszabbítási lépést egybevettük: 62°C 40 másodperc. A program többi része az I példában bemutatott protokollnak felel meg.

13.2.4.3. Kiértékelés

Az I. példafeladat lépéseit követve végezzük a szoftveres kiértékelést:

1) Tekintsük át, hogy minden zsebben volt-e megfelelő amplifikáció, valamint, hogy az amplifikációs görbék megfelelő lefutásúak-e minden mintánál (13.14. ábra). Ellenőrizzük, hogy a negatív Kontroll mintákban kaptunk-e amplifikációt. Ellenőrizzük a disszociációs protokoll alapján kapott olvadási görbéket (13.15. ábra)

13.14. Ábra. A kísérleti és az NTC mintákhoz tartozó amplifikációs görbék logaritmikus nézetben.

13.15. Ábra. Az összes mintában található amplikonok olvadási görbéi.

2) Az alapvonal beállítása

3) Küszöbérték beállítása

4) Mennyiségi meghatározás Standard görbe alapján

A hígítási sor alapján a Standard görbe és paraméterei az Lhcb5 GOI-re. (m=-3.597234, a hatékonyság ez alapján: 89.7%)]

13.10. Táblázat. Az ABI Prism 700 SDS szofterrel kiértékelt reakció. Ct értékek és a Standard görbe alapján számolt relatív Lhcb5 GOI mennyisége a 10 kísérleti mintában. (Alapvonal:1-8 ciklus. Küszöbérték: 1.1)

Normalizáció belső Referencia génekkel

Az egyes mintákban lévő cDNS-ek mennyiségét a Kalibrátorként szolgáló mintához képest meghatároztuk. Tehát a kísérletes mintáink egymás között összehasonlíthatóvá váltak. Szükség van viszont a bemért cDNS mennyiségének korrigálására, vagyis a normalizációra. Ehhez a kísérleti mintákban stabilan kifejeződő 3 belső Referencia gén transzkripció szintjéből számolt normalizációs faktort használjuk. Az egyes mintákban mért Lhcb5 mRNS mennyiséget osztjuk a normalizációs faktorral, ezzel egyforma mennyiségű bemért mRNS-re (cDNS-re) normáljuk a reakciót.

13.11. Táblázat. Az Lhcb5 belső Referencia génekre normalizált relatív mennyisége

Normalizáció RiboGreen módszerrel

Az előző módszerhez hasonlóan járunk el a relatív mennyiségek meghatározásában. Ebben az esetben azonban normalizációs faktorként a RiboGreen fluoreszcenciáját használjuk az egyes mintákban és ezzel osztjuk a korábban a standard görbe alapján kapott relatív mRNS mennyiségeket.

13.12. Táblázat. Az Lhcb5 mRNS szintjének RiboGreen módszerrel normalizál relatív mennyiségei a 10 kísérleti mintában.

13.16. Ábra. Az Lhcb5 normalizált relatív mennyiségei a belső Referencia génekhez (A), valamint az összes bemért cDNS-hez viszonyítva (B).

Láthatjuk, hogy az Lhcb5 gén kifejeződése a különböző fejlettségű Kontroll levelekben is eltérő volt. A Cd- stressz hatására lényegesen lecsökkent az mRNS mennyisége a 7 és 14 napos felső levelekben. A kétféle normalizáció kissé eltérő transzkripciós mintázatot mutat. A 4 napos fejlődő levelekben ugyanis a Referencia génekhez viszonyítva nem változik a transzkripció Cd hatására, ha viszont az összes mRNS mennyiségéhez viszonyítjuk, csökkenést tapasztalunk. Az eltérés oka a belső Referencia gének kifejeződésének ingadozásában keresendő.

Fontos következtetésként vonhatjuk le, hogy eredményeink értelmezése szempontjából alapvető jelentőségű az értékeléshez választott normalizációs módszer.