14.5. A detergensek kiválasztása

A membránfehérjékkel való munka első fontos lépése kiválasztani azt a detergenst, ami a fehérjéket oldhatóvá, szolubilissá teszi és így azok könnyen eltávolíthatók a mintából. Egy adott feladathoz a megfelelő detergens kiválasztásához a legegyszerűbb út az irodalmi adatok felhasználása, akár konkrét egyezések, akár közeli hasonlóságok alapján. Új módszer, technika kipróbálásánál azonban számos körülményt kell figyelembe venni.

A detergens kiválasztásánál fontos szempont, hogy milyenek a kísérleti feltételek (hőmérséklet, pH, ionerősség, ionösszetétel, egyéb vegyületek jelenléte). Oldható-e az adott detergens a kísérlet hőmérsékletén? Pl. a Zwittergent család tagjai nem oldhatók 4oC-on, ezért hidegszobai munkához nem használhatók.

Elég nagyméretű micellák képződnek-e, amelyek alkalmasak a fehérjék szolubilizálásához? Pl. a Na-glikodezoxikolát aggregációs száma vízben 2, de 0.15 M-os NaCl oldatban már 20.

Milyen további lépések lesznek a szolubilizálást követően? Milyen lehetséges eljárások alkalmazhatók, ha az alkalmazott detergenst el kell távolítani a rendszerből?

Milyen, esetleg zavaró hatás várható a detergens jelenléte miatt, pl. spektroszkópiai vizsgálatok során (UV-VIS abszorpció, fluoreszcencia spektroszkópia), vagy fehérje meghatározási módszerek alkalmazásánál. Pl. a TRITON család tagjai elnyelnek UV-ben, ugyanakkor léteznek nem-abszorbeáló, hidrogenált származékaik is.

Zavarja-e a kiválasztott detergens az alkalmazni kívánt, töltés-alapú elválasztási módszereket, pl. az izoelektromos fókuszálást? Az ionos detergensek, kötődve a fehérjékhez, megváltoztatják azok natív töltését, míg a nem-ionosak nem. Egyes detergensek komplexet képeznek az amfolitokkal.

Befolyásolja-e az adott detergens az elválasztást követő festési eljárást? Egyes detergensek reakcióba lépnek festékekkel, illetve a fixálásnál alkalmazott vegyületekkel, míg mások olyan műterméket képezhetnek, amelyek zavarják az elektronmikroszkópos felvételeket.

A méret szerinti elválasztási technikáknál (gélszűrés, gélelektroforézis) jelentősége van a micellák méretének, illetve a fehérje-micella és szabad micella mérete közötti különbségnek.

Fontos szempont, hogy a kiválasztott detergens milyen hatással van a fehérjékre, különös tekintettel arra, hogy a fehérjéket majd natív szerkezettel, aktív állapotban vagy denaturált állapotban kell vizsgálni. Figyelembe kell venni a membránkötött fehérje helyzetét is (extrinsic vagy intrinsic fehérjék). A fehérjék teljes szolubilizálása, alegységekre történő bontása esetén általában erőteljes, ionos detergenseket használnak (SDS). Érdemes figyelembe venni, hogy a hosszú szénláncot tartalmazó detergensek denaturáló hatásúak, mivel megbontják a fehérjék hidrofób régióit. A kiválasztott detergens denaturáló hatásának megállapításához szükség lehet a detergens-kezelt és a kezeletlen minta összehasonlítására. Enyhébb szolubilizáló hatású ionos, iker-ionos, illetve nem-ionos detergensek használatával megőrizhető a fehérje alegységszerkezete, enzimatikus aktivitása, illetve a hozzájuk nem-kovalensen kötődő, nem-fehérje természetű kofaktorok jelenléte is (dodecilglukozid, dodecilmaltozid, N-gluko-N-metilalkánamidok, dezoxikolát, CHAPS, TRITON). Ezek a detergensek általában könnyen eltávolíthatók a szolubilizálás után a mintából dialízissel. További kérdés, hogy a szolubilizált mintában, a detergens eltávolítása után megmarad, illetve helyreáll-e az eredeti struktúra?

A detergens/fehérje arány megállapítása kritikus pontja a szolubilizálásnak. Ezért ehhez ismerni kell a minta fehérjetartalmát. A jó arány eldöntéséhez koncentráció sort kell kipróbálni mind fehérjetartalomra (pl. 5, 7.5, 10 mg fehérje/ml), mind detergensre (5, 7.5, 10 mg detergens/g fehérje), figyelembe véve a detergens CMC-át, illetve az irodalmi adatokat. Általában érvényes, hogy a detergensek a CMC-juk körüli értéknél a leghatékonyabbak és inkább alacsonyabb fehérje koncentrációknál.

Fontos tényező az oldat ionereje, ami befolyásolja a membránkötött molekulák közötti kölcsönhatásokat. Az ionos kölcsönhatások csökkenthetők növekvő sókoncentrációval, ami a membránfehérjék a membránból, és/vagy más molekuláktól való hatékony disszociációjához vezet. A kezdeti kísérleteknél pl. 0.1 és 0.5 M közötti KCl vagy NaCl javasolt. Ha a detergensekhez csak korlátozott hozzáférési van, ajánlott az oktilglukozid, a CHAPS vagy a kolát. Különösen a kolát lehet hatékony magasabb sókoncentráció mellett. A magasabb ionerő maszkírozza a fehérjék töltését és egyúttal csökkenti a detergens CMC-ját.

Nem elhanyagolható az oldat pH-ja, illetve pufferkapacitása. Tekintettel kell lenni az oldat összeállításánál a későbbi lépéseknél alkalmazott fehérjeelválasztási módszerekre (ioncserélő kromatográfia, izoelektromos fókuszálás), valamint arra, hogy a pufferrendszer komponensei ne lépjenek reakcióba a minta molekuláival.

Számításba veendő körülmény az alkalmazott hőmérséklet és a szolubilizálás időtartama. A kezdeti kísérleteknél ajánlott a 4oC és 1 h, enyhe keverés mellett. Más esetekben hatékony lehet a szolubilizásás 37oC-on, de rövidebb ideig (1-5 perc). A nem megfelelő hőmérséklet választásánál vagy a szolubilizálás hatékonysága alacsony, vagy a minta molekulái sérülhetnek.

Felmerülhet a kérdés, hogy vajon az adott detergens mennyire toxikus. Pl. a digitonin a szívműködésre ható glikozid, ezért fokozott óvatossággal kell kezelni.

Kérdés lehet, hogy vajon a detergenssel nem lép-e reakcióba a mintaoldat valamely komponense? Pl. alkilglukozidokat, maltozidokat nem célszerű alkalmazni, ha a mintában glukozidáz enzim van jelen.

Végül nem teljesen mellékes körülmény, hogy a kiválasztott detergens milyen tisztaságú és mennyibe kerül.