15.6. A centrifugálás közege

A centrifugálás során, az esetek többségében, különböző tulajdonságú részecskék szétválasztása történik, amelyet általában egy dezintegráló homogenizálás előz meg. A homogenizáláshoz és a centrifugáláshoz is megfelelő közeget kell választani, amely biztosítja, hogy a biológiai minta a kívánt mértékben megőrizze natív struktúráját és funkcióit. Optimalizálni kell a közeg pH-ját, ozmotikus koncentrációját, ionerejét. Ugyanakkor különböző antioxidánsok, kelátképzők, membránvédő faktorok és antitoxikus anyagok is alkalmazhatók. Míg a differenciál centrifugálás során a minta végig egy, vagy több homogenizáló médiumban van, a gradiens centrifugálás során különböző gradiensképző anyagokat is fel kell használni, amelyeknek számos követelménynek kell megfelelniük: a gradiens anyag legyen inert, de legalábbis ne legyen toxikus, ismertek legyenek a fiziko-kémiai tulajdonságai, legyen vízoldható, ozmotikusan és optikailag inaktív, kellőképpen, de ne túlzottan viszkózus, könnyen elválasztható legyen a minta részecskéitől és legyen olcsón hozzáférhető, esetleg visszanyerhető. Mivel az alkalmazott gradiens anyagok egyike sem elégíti ki az összes kívánalmat, ezért egy adott biológiai minta elválasztásához a legmegfelelőbbet kell kiválasztani (ld. irodalom).

15.6.1 Az ismertebb gradiensanyagok tulajdonságai és felhasználási területeik:

15.6.1.1 Nem-ionosmédiumok

Cukor (szacharóz): ideális gradiens anyag, de erős ozmotikum, csak magasabb koncentrációban viszkózus, pH=3 alatt a glikolitikus kötés instabil. Autoklávozásnál karamellizálódhat. Felhasználják az izopiknikus elválasztásnál, sejtorganellumok, vírusok, makromolekuláris komplexek elválasztására.

Glicerin: analitikailag igen tiszta, benne számos enzim megőrzi aktivitását, de erősen viszkózus. Elsősorban enzimek elválasztására használják.

Poliszacharidok (glikogén, dextrán, Ficoll): ozmotikusan inertek, de magas a viszkozitásuk. Stabil gradiens készíthető belőlük. Sejteket, sejtorganellumokat és membránokat izolálnak bennük.

Jodinált gradiens anyagok (iothalamát, metrizamid, Nycodenz): kis ozmolalitású, kevéssé viszkózus anyagok, széles körben használhatók, de az UV-ban elnyelnek. Felhasználják nukleinsavak, fehérjék, nukleoproteidek, sejtek, sejtorganellumok, vírusok izolálására.

Szilika kolloidok (Ludox, Percoll): 3-20 nm átmérőjű részecskéket tartalmaz, nem toxikus, ozmolalitása alacsony, igen stabil, de az alacsony pH-ra és a nagy ionerőre érzékeny. Önbeálló (self-forming) gradiensanyag. A szilika kolloidok felületét polivinilpirrolidinnel vonják be. Ez csökkenti a kölcsönhatást és növeli az inertséget, de erősen nyelnek el az UV-ben. Sejtorganellumok, sejtek, membránkomplexek, baktériumok, vírusok elválasztására alkalmas.

Proteinek (bovine serum albumin, BSA): ozmotikusan inertek, viszkózusak, de az UV-ban elnyelnek. Sejtek, intakt sejtalkotók izolálására alkalmasak.

15.6.1.2 Ionos médiumok

Cézium sók: főként izopiknikus elválasztáshoz alkalmazzák. Nagy ionerejű és ozmotikusan aktív, elég viszkózus vegyületek. Self-forming gradiensképzők. Nukleinsavak, plazmidok, DNS és RNS fragmentek izolálására alkalmazzák.

K, Na-és Rb sók: kis sűrűségű és viszkozitású anyagok. Főképp lipoproteineket, RNS és DNS fragmenteket izolálnak bennük.

15.6.2 Centrifugálási közeg kiválasztása (alapvetően támaszkodva az irodalmi adatokra)

15.6.3 Gradiensek előállítása

Alapvetően kétféle gradiens állítható elő, lineáris és szakaszos gradiens. A lineáris gradiens készítése (öntése) a centrifugáláshoz használt csőben történik, egy alul összekötött, csappal elzárható, két hengert tartalmazó öntőedény segítségével. A két hengerbe a gradiens anyag hígabb, ill. töményebb koncentrációjú oldata kerül. A kifolyás a hígabb oldatot tartalmazó edényből indul a centrifugacsőbe, amely a töményebb oldat felöl folyamatosan töményedik. A koncentráció határok kiválasztását az elválasztandó részecskék tulajdonságai szabják meg. A kifolyás a hígabb oldatot tartalmazó edényből történik, amelyet a töményebb oldat állandóan pótol. Így a centrifugacsőben emelkedő folyadék koncentrációja folyamatosan változik, fentről lefelé töményedik. Az un. self-forming gradiens anyagokból előzetes centrifugálás segítségével állítható elő stabil, lineáris gradiens. A szakaszos gradiensek készítése több lépcsőben történik, ahol az egyes eltérő koncentrációjú (sűrűségű) oldatokat rétegezik egymásra. Az elválasztandó biológiai mintát általában a gradiens tetejére rétegezik, ritkábban, egyenletesen eloszlatva, a gradiens tartalmazza (izopiknikus elválasztás egy esete).

A centrifugálás, mint elválasztási módszer rendkívül változatos lehetőséget nyújt különböző biológiai anyagok izolálására. A hatékony és eredményes munkához azonban a körülmények (centrifugálás típusa, közeg) és a berendezés (centrifuga, rotor, cső) helyes megválasztása szükséges.