15.7. Gyakorlat

Gradiens centrifugálás (Caffarri et al.,JBC 276: 35924-33, 2001)

Szolubilizálás:

Sz: 20 mM HEPES (pH 7.5)

500 mM HEPES (pH 7.5)

0.2 ml → 5.0 ml-re bidv-zel

Körülmények: 500 ug ml-1 Chl, 0.6% DDM, 1 min Vortex, 10 min 15000xg cf.

Gradiens: (glicerinnel lassabban válik szét, de szebb a szétválás)

0.1M: 10 mM HEPES (pH 7.5), 0.1 M szaharóz, 0.05% DDM (5% glicerin)

500 mM HEPES (pH 7.5)

1.0 ml

szaharóz:

1.712 g

DDM

25 mg

(glicerin

2.5 g)

→ 50 ml-re bidv-zel

1.0M: 10 mM HEPES (pH 7.5), 1.0 M szaharóz, 0.05% DDM (5% glicerin)

500 mM HEPES (pH 7.5)

1.0 ml

Szaharóz:

17.115 g

DDM

25 mg

(glicerin

2.5 g)

→ 50 ml-re bidv-zel

2.0M: 10 mM HEPES (pH 7.5) 2.0 M szaharóz, 0.05% DDM (5% (v/v) glicerin)

500 mM HEPES (pH 7.5)

0.5 ml

Szaharóz:

17.115 g

(glicerin

2.5 g)

→ 25 ml-re bidv-zel

Minta: szolubilizált tilakoid

Vak gradiens:

0.1MV: 0.1 M szaharóz

2.115 g→ 75 ml-re bidv-zel

1.0MV: 1.0 M szaharóz

25.673 g→ 75 ml-re bidv-zel

2.0MV: 2.0 M szaharóz

17.115 g→ 25 ml-re bidv-zel

Vak minta: DCPIP oldat a gyakorlatról

Kivitelezés: 6 ml 0.1M/0.1MV és 6 ml 1.0M1.0MV oldatból gradienskeverővel gradienst öntünk a centrifugacsövekbe. Fecskendővel alárétegezünk 1 ml 2.0M/2.0MV-t. A gradiensre 0.5 ml mintát, ill. vak mintát rétegezünk. 22 h ultracentrifugálás 28000xg-vel. Ezután a gradiensen megjelenő sávokat leszívjuk/a gradienst frakcionáljuk. Az elválasztott sávok azonosításához felvesszük az abszorpciós spektrumukat/meghatározzuk Chl a/b arányukat/fehérjeösszetételüket. Az utóbbihoz a mintát szolubilizáljuk: 100 µl mintához 50 µl 3x tömény Laemmli szolubilizáló oldatot (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 2% merkaptoethanol, 10% glicerin, 0.001% brómfenolkék) adunk, és 30 percig szobahőmérsékleten néha vortexelve szolubilizáljuk. A mintákat Laemmli gélelforetikus rendszerrel elválasztjuk.