Elektronmikroszkópia

A fénymikroszkópok feloldóképességénél és nagyításánál, mint láttuk, maga a fény hullámhossza a fő korlátozó tényező. A felgyorsított elektronokkal nagyságrendekkel rövidebb hullámhossz és ezáltal sokkal jobb feloldóképesség és nagyítás érhető el. A mai elektronmikroszkópok atomi szintű (<1 Å azaz 0,1 nm) feloldóképességgel rendelkeznek, bár ez a biológiai minták vizsgálatakor a gyakorlatban nem érhető el.

Transzmissziós elektronmikroszkóp fotója.

Biológiai transzmissziós elektronmikroszkóp készülék (TEM)

Alapvetően két fő elektronmikroszkópos technikát, és ennek megfelelő készüléket kell elkülönítenünk, a transzmissziós elektronmikroszkópot (TEM) és a scanning elektronmikroszkópot (SEM). A transzmissziós elektronmikroszkóp a minta átvilágításával, a fénymikroszkópokhoz hasonló módon működik, de fény helyett gyorsított elektronokat, az optikai lencsék helyett pedig elektromágneses lencséket használ. A képet az elektronok becsapódásának hatására fluoreszkáló ernyőn látjuk. A TEM-ben csak nagyon vékony (kb. 50–100 nm) mintákat vizsgálhatunk, mivel az elektronok áthatolóképessége igen gyenge. A képet leegyszerűsítve egy árnyképnek kell elképzelni, vagyis ahol a mintában az elektronokat eltérítő nagy rendszámú elemek vannak, onnan kevés elektron jut el az ernyőig és sötét lesz a kép, ahol pedig könnyű elemek vannak, melyek nem tudják olyan mértékben eltéríteni az elektronokat az eredeti irányuktól ott világos lesz a kép. Ezért festjük (kontrasztozzuk) az elektronmikroszkópos mintákat nehézfémekkel.

Scanning elektronmikroszkóp fotója.

Rutin biológiai scanning elektronmikroszkóp berendezés (SEM)

A scanning vagy pásztázó elektronmikroszkóp egy „fél” transzmissziós elektronmikroszkóp, mivel elektronforrással, megvilágító lencserendszerrel ugyanúgy rendelkezik, mint a TEM, de a mintába becsapódó elektronok nem a hagyományos képalkotási elvek szerint hozzák létre a képet, ezért a képalkotó optika hiányzik. Az elektronsugár a lézer scanning mikroszkópokhoz hasonlóan pontról-pontra pásztázza végig a mintát, és az onnan visszaszóródott, vagy a mintában ionizáció révén keletkezett elektronokat detektáljuk. Ebből a pontonként kiváltott jelből a számítógép hozza létre a képet. A SEM-ben ezért bármilyen vastag mintát vizsgálhatunk, a kép csak a felszíni rétegből származó elektronokból jön létre. Ennek megfelelően a SEM kép térhatású, viszonylag nagy mélységélességű felszíni leképezés.

Transzmissziós elektronmikroszkóp szerkezetét mutató ábra. A piros vonalak jelzik az elektronnyaláb útvonalát.

Transzmissziós elektronmikroszkóp felépítése az elektron-nyaláb sugármenetének feltüntetésével.

Scanning elektronmikroszkóp felépítését bemutató blokkrajz.

Scanning elektronmikroszkóp felépítése, elektronoptikai elemei.

Elektronmikroszkópos mikrotechnika

Az elektronmikroszkópos mikrotechnika sok szempontból hasonló a fénymikroszkópos mintaelőkészítéshez, és történelmileg abból is alakult ki. Mivel a nagy feloldóképesség a legfinomabb mintakezelést igényli, szóba sem jöhetnek a koagulatív fixálószerek. Elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz a rutin fixálószer glutáraldehid a fehérjék térhálósítására, és ozmium-tetroxid a lipidek fixálására. Ez utóbbi további előnye, hogy egyben kontrasztanyagként is működik, az ozmium erős elektronszóró képessége miatt. A fixálandó anyagnak igen kisméretűnek kell lennie (egyik irányban maximum 2 mm), mivel a fixálószer penetrációja lassú, és ez vastagabb minta esetén rossz fixálást eredményezne. A fixálást mosás, majd víztelenítés követi. Ezután a mintát műgyantával kell átitatni (főként epoxy, speciális esetben metakrilát), kiöntő formába helyezni, és polimerizáltatni. A minta metszését (epoxy gyanta esetén) ún. káddal ellátott üveg, vagy gyémánt késsel végezzük. Ennek lényege, hogy a vágás során a metszet ráúszik a kádban levő víz felszínére, ahonnan könnyen összegyűjthető az elektronmikroszkóp mintatartójául szolgáló apró rácsra (mikrostély vagy grid).

Ultramikrotóm fotója, jobbra a mechanikai, balra a vezérlő egységgel.

Ultramikrotóm és vezérlő egysége (balra).

Kések. Balra frissen tört üvegkés, jobbra gyémántkés.

Száraz üvegkés, és csónakkal szerelt gyémántkés. A metszést az üvegkés tört élével, illetve a csiszolt és fémházba foglalt gyémánttal (csillogó rész) végezzük.

Gyémántkéssel történő ultravékony metszetek készítését ábrázoló fotó.

Metszés ultramikrotómmal, gyémántkéssel.

Három, eltérő lyukméretű mikrorostély.

Az ultramikrotómmal készített metszetek 3 mm átmérőjű mikrorostélyokra (grid) kerülnek. A gridek rácshálózata sűrűségében, azaz lyukméretében is különböző lehet. A különböző méretű beágyazott anyagokból készült és ezért eltérő méretű metszeteket a megfelelő lyukméretű rostélyra kell „felvenni”.

A mikrorostély rácsa fekete négyzethálóként látható, a ráfekvő metszet szürke színű.

Ultramikrotómmal készített metszet a mikrorostély rácshálózatára kiterítve (kis nagyítású TEM fotó a grid egy részletével).

Az összegyűjtött metszeteket még uranil-acetáttal és ólom-citráttal kontrasztosítjuk (festjük), hogy a TEM-ben megfelelő kontrasztú képet kapjunk. Minél több nehézfémsó kötődik egy adott struktúrához, annál több elektront fog elnyelni, szórni, eltéríteni az eredeti irányából. Ezek a részletek sötéten jelennek meg a képen, vagyis elektrondenzek.

A scanning elektronmikroszkópos mintaelőkészítés csak az első lépésekben hasonlít a TEM-es preparáláshoz. A minta mérete itt nem korlátozó tényező, hiszen csak a felszín jó megőrzése a feladat. A fixálószer kiválasztása sem mindig kritikus. A víztelenítés után a SEM-es vizsgálatokhoz a mintát egy igen vékony vezetőképes réteggel kell bevonni, egyébként a belőtt elektronok nem vezetődnének el, és a minta töltődése nagyon lerontaná a képalkotás lehetőségét. A mintát legtöbbször arannyal, szénnel, vagy palládiummal (esetleg ezek keverékével) vonjuk be, úgy, hogy a fémet nagy vákuumban a mintára gőzölögtetjük. A vákuum miatt a mintának teljesen száraznak kell lennie. (Egyébként a hagyományos mikroszkópokban is, akár TEM, akár SEM nagy vákuum van, mivel az elektronok a levegőben szóródnának.) A minták kiszárítását általában a kritikus pont szárító berendezéssel végezzük. A folyamat lényege, hogy minden anyagnak van egy olyan, ún. kritikus pontja a nyomás-hőmérséklet diagramon, amely értékek felett a folyadék és gáz fázis nem különíthető el, vagyis a felületi feszültség megszűnik. Ez lehetővé teszi a mintából az adott anyag elpárologtatását oly módon, hogy közben a felületi feszültség okozta struktúraváltozások elkerülhetők. Mivel a széndioxid kritikus pontja viszonylag könnyen elérhető (7,38 MPa = 73,8 bar és 31,1°C) a víztelenítő anyagot folyékony széndioxidra cseréljük ki, és ezt párologtatjuk el a készülékben. Ezek után a száraz minta már fémgőzölhető és SEM-ben vizsgálható.

Kriotechnika

Az elektronmikroszkópos mintaelőkészítés egy alternatív lehetősége a minta hirtelen lefagyasztása és bizonyos lépések alacsony hőmérsékleten történő kivitelezése. A kriofixálás során a mintát olyan gyorsan kell lehűteni, hogy a benne levő víz ne tudjon jégkristályokká alakulni, hanem eredeti formájában szilárduljon meg, vitrifikálódjon. A jégkristályok ugyanis nagyobb térfogatúak, mint a víz és a kristályképződés is struktúra-roncsoló hatású. Ehhez a mintát 108 fok/s sebességgel kell hűteni, ami csak a felszíni kb. 5–10 µm vastagságú rétegben valósítható meg normál körülmények között. A nagy nyomású kriofixáló berendezésekkel ez a vastagság kb. egy nagyságrenddel növelhető. A kriofixálást általában folyékony nitrogén hőmérsékletére (-196°C) lehűtött propánnal végzik, mivel ez hatékonyabban hűt, mint az állandó forrásban levő, és ezért gőzbuborékokat képző folyékony nitrogén. A folyékony nitrogén hőmérsékletén gyakorlatilag minden reakció leáll, ezért ideális fixálási módszer. A kérdés az, hogyan lehet a kriofixált anyagot vizsgálatra alkalmassá tenni. A legmodernebb és egyben legköltségesebb megoldás, ha a mintát egyáltalán nem engedjük olyan hőmérsékletre felmelegedni (kb. -100°C), hogy a kristályosodás megtörténjen. A mintát ekkor alacsony hőmérsékleten kell metszeni és speciális elektronmikroszkópban vizsgálni. Mivel ilyenkor a mintában nincsenek nehéz atomok, a képalkotás is speciális módon történik. Lehetőség van azonban arra is, hogy a mintából a vitrifikált vizet eltávolítsuk anélkül, hogy az átkristályosodna. Ehhez vagy alacsony hőmérsékleten ki kell oldani (freeze substitution) vagy vákuumban el kell szublimáltatni (freeze drying). Az így előállított mintákat ezután már a hagyományos mikrotechnikai eljárásokkal lehet beágyazni, és metszeni.

A kriotechnikákhoz tartozik az a gyakorlati szempontból (immuncitokémia) fontos módszer, amikor magát a metszést alacsony hőmérsékleten végezzük, annak ellenére, hogy a fixálás nem alacsony hőmérsékleten történt. A mintákat szacharóz oldattal itatjuk át, ami meggátolja a jégkristályok kialakulását, és egyben könnyen metszhető fagyott állapotban. A kriomikrotómmal így előállított metszetek felolvasztást követően jelölhetők antitestekkel, és kiszárítás után vizsgálhatók az elektronmikroszkópban. Az elektronmikroszkópos immuncitokémiához az antitesteket néhány nm átmérőjű aranyszemcsékkel jelölik meg, melyek erősen elektronszórók, és így kontrasztos fekete pöttyökként jelennek meg a mikroszkópi képen. (Metakrilát gyantába ágyazott mintából készült metszetek is alkalmasak immuncitokémiai jelölésre, de eredményességük messze elmarad a kriometszett anyagokétól.)

Az elektronmikroszkópos kép értelmezése – Műtermékek

A mikroszkópi kép értékelésekor a mikrotechnikai előkészítés hatását figyelembe kell venni, nem létezik ugyanis olyan módszer, mely ne okozna valamilyen műterméket. Az anyagok egy része kioldódik a mintából, más része reakcióba lép a felhasznált reagensekkel, ozmotikus változások torzíthatják a struktúrát, összecsapzódások, kristályosodási folyamatok befolyásolják az eredeti állapotot. Műtermék keletkezhet az előkészítő eljárások során, a beágyazás alatt, a metszet készítésekor és kontrasztosításakor egyaránt. Alább bemutatunk néhány műtermék típust, amely megnehezíti, vagy éppen lehetetlenné teszi a mikroszkópi kép értelmezését.

Az ultravékony metszeteken fekete színnel feltűnő struktúrák műtermékek, kristályos csapadékok.

Műtermék I. – A metszet kontrasztosítása során annak felületére került csapadékok zavarják vagy lehetetlenné teszik az érintett terület értékelését. A kialakuló csapadék mérete, alakja, kompakt vagy diffúz volta a kristály anyagi minőségétől és kialakulásának körülményeitől függ. Balra és középen határozott, szabályos alakú, jellemző méretű, a jobb oldali képen szabálytalan alakú, összecsapzódott kristályok láthatók.

Az ultravékony metszeten a jobbra dőlő világosabb és sötétebb sávok alkotják a chatter mintát, a baloldalról a kép jobb alsó sarkába húzódó két sötétebb sáv késcsík.

Műtermék II. – A minta ultramikrotómban való elégtelen rögzítéséből vagy a túlságosan lágy műgyanta következtében a metszeten változó vastagságú, ritmikusan ismétlődő, egyenetlen sávok jelennek meg, ún. chatter mintázat alakul ki. A kés élének hibája okozza a metszeten egyenes vonalban végighúzódó sávot, a késcsíkot. (TEM felvétel)

A hosszú fonalhoz csatlakozó, csepp alakú fekete struktúrák a metszet felületére került baktériumok.

Műtermék III. – A kés használatát követően a kés csónakjának nem kellő tisztítása és szárítása miatt baktériumok telepedhetnek meg és kerülhetnek az újabb metszetek felületére (TEM felvétel).

A fotó felső részén a sötét sáv jelzi a metszet meggyűrődött sávját.

Műtermék IV. – A metszetek mikrorostélyra történő felvételekor előfordul, hogy metszet anyaga „felgyűrődik”, saját magára visszahajlik. A gyűrődés területén a metszet háromszorosan rétegződve fekete sávként tűnik fel. A fotón a gyűrődés a kép felső részében látható (TEM felvétel).

A fotón a világos foltok jelzik a metszet megjelent nyílást, lyukat.

Műtermék V. – Amennyiben a metszet túl vékony, vagy a műgyanta nem egyenletesen tölti ki a mintát, a metszet készítése során vagy az elektronmikroszkópos vizsgálat hatására a metszet kilyukadhat. A lyuk körül a metszet alakváltozása az eredeti struktúra arányainak változását idézi elő. (TEM felvétel)

Ha ismerjük, hogy az adott eljárás milyen műtermék képződését okozhatja, reálisabban tudjuk értékelni a kapott képet. Azt is figyelembe kell vennünk, hogy egy metszet – különösen a TEM esetében – a sejtnek csak egy igen kis szelete. Egy 100 µm (100 000 nm) átmérőjű sejtből kivágva egy 50 nm-es szeletet olyan, mintha az egyetem szerkezetét egy véletlenszerűen kivágott 1 cm-es szeleten vizsgálnánk. A vékony szeletek abból a szempontból is megtévesztőek lehetnek, hogy nem tudunk belőlük a térbeli viszonyokra közvetlenül következtetni. Egy vakuólában található membránnal körülvett mitokondrium lehet, hogy csak a vakuólum beöblösödésébe benyúló citoplazma részlet. Ezek a problémák rávilágítanak arra, hogy milyen fontos a korrelatív fény- és elektronmikroszkópia, vagyis az azonos részek fénymikroszkópos, majd elektronmikroszkópos összehasonlító vizsgálata. A térbeli viszonyok megismerésében igen nagy segítséget jelentenek az olyan háromdimenziós rekonstrukciós mikroszkópi technikák, mint például a CLSM (Confocal laser scanning microscopy), vagy az elektrontomográfia.

Kérdések:

  1. Mi a fénymikroszkópok feloldóképességének határa?

  2. Milyen mikroszkópok alkalmasak az élő sejtek és festetlen minták kontrasztjának növelésére?

  3. Milyen alapon csoportosíthatók a fénymikroszkópos fixálószerek?

  4. Miért kell a beágyazandó mintát vízteleníteni?

  5. Mik a legelterjedtebb beágyazóanyagok a fénymikroszkópos mikrotechnikában?

  6. Milyen fő elektronmikroszkóp típusok vannak?

  7. Mekkora az elektronmikroszkóp feloldóképessége?

  8. Mivel fixálunk a rutin elektronmikroszkópos (TEM) vizsgálatokhoz?

  9. Milyen vastag egy elektronmikroszkópos metszet?

  10. Milyen késsel készítjük az elektronmikroszkópos metszeteket?

  11. Milyen vastagságban tudunk kriofixálni?