Szövettani preparátumok, metszetek készítése

A biológiai anyag előkészítésének általános menete

A megfelelő vékonyságú, mikroszkóppal átvilágítható minta előállítása érdekében a célunk egy jól „szeletelhető”, metszhető minta, ún. blokk előállítása. Az előkészítő eljárás főbb lépései és ezek céljai a következők:

  1. Anyagpreparálás és rögzítés (fixálás): az élő anyag strukturális és kémiai stabilizálása. A szövettani készítmények előállításához a szervet vagy szövetdarabot a szervezetből ki kell emelni, szerkezetét rögzítőszerekkel vagy megfelelően kivitelezett fagyasztással meg kell őrizni, bomlását meg kell akadályozni.

  2. Kimosás: a rögzítőszer eltávolítása vízzel vagy egyéb oldószerrel. Fagyasztott minta esetében természetesen ezt a lépést kihagyjuk.

  3. Víztelenítés (dehidrálás): a rögzítőszerekkel fixált szövet víztartalmának vízelvonó szerekkel történő eltávolítása. Erre azért van szükség, mert a jó metszhetőséget biztosító beágyazószerek általában nem vízoldékonyak.

  4. Beágyazás: a vizsgálandó anyag folyékony beágyazószerekkel történő átitatása és a beágyazásra használt közeg kikeményítése, azaz blokk előállítása. Ennek mechanikai tulajdonságai már lehetővé teszik azt, hogy belőle megfelelő vékonyságú, átvilágítható preparátumot, metszetet készítsünk. Fagyasztott minta esetében a beágyazószer a sejtek, szövetek természetes közege, azaz maga a víz, amely megfelelő körülmények között lehűtve nem képez membránokat károsító jégkristályokat.

  5. Metszetkészítés: a blokk felszeletelése a kiértékeléskor alkalmazott mikroszkóp fajtájának megfelelő vastagságban. A fagyasztott mintát is tudjuk metszeni.

  6. Festés: a szövetelemek fény-, illetve elektronszórásbeli különbségeinek növelése. A fénymikroszkópos metszeteket ezután lefedjük, ami a hosszú eltarthatóságukat is biztosítja. Ritkán az elkészült metszeteket festés nélkül is vizsgálhatjuk.

A mikrotechnikai eljárás kompromisszumok sorozata, mivel a vizsgálandó anyag mindvégig olyan reagensekkel kerül közvetlen kontaktusba, amelyek valamilyen módon hatnak rá. Tökéletes, minden kívánalomnak megfelelő rögzítő-, beágyazó- és víztelenítőszerek nincsenek, ezért a végső cél érdekében az adott reagens néhány hátrányos tulajdonságával mindig meg kell alkudnunk. Az egész eljárást a vizsgálat céljának leginkább megfelelően kell alakítanunk, s az egyes lépések megtervezésénél nélkülözhetetlen a tapasztalati (irodalomban rögzített) adatok figyelembevétele.

A következő leírásunkban a fénymikroszkópos szintű vizsgálatokhoz szükséges alapvető ismereteket mutatjuk be. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az itt említésre kerülő vegyszerek és eljárások nem feltétlen alkalmasak olyan preparátumok készítésére, amelyeket a fénymikroszkópi felbontást meghaladó, ultrastrukturális szinten (elektronmikroszkóppal) kell kiértékelni (l. műtermékkel kapcsolatos fenti megjegyzés). Az ez irányú ismereteket az Elektronmikroszkópia című fejezetben foglaljuk össze.

A mintavétel és a rögzítés néhány szabálya

Szövettani mintavétel történhet élő emberből és állatból, műtéti eljárásban (biopszia), vagy a halál beállta után, a tetem boncolásakor (autopszia). Az előkészítő munkálatok és a műtét során figyelnünk kell arra, hogy az állatnak feleslegesen ne okozzunk fájdalmat vagy kellemetlenséget. A minden kutatótól elvárható empátián kívül ez azért is fontos, mert a rosszul tartott és nem kellő gondossággal megfogott, kezelt és táplált állatokban stresszreakció léphet fel, ami számos esetben torzíthatja a minta értékelhetőségét.

Figyelnünk kell arra is, hogy a kivételre kerülő szervet minél gyorsabban fixáljuk. A halál beálltával, vagy az adott szerv működésének megszűnte után pl. megváltozhat a mellékvesekéreg C-vitamin-tartalma, vagy egy izomszövetben az egyes rostok ATP-és ATP-áz-tartalma, illetve aktivitása, a szénhidrátok mennyisége stb.

A szerv eltávolításánál ne fogjuk meg csipesszel magát a vizsgálandó szervet (vagy ha ez elkerülhetetlen, igen óvatosan tegyük), mert ezzel annak roncsolódását okozhatjuk. Az a legjobb, ha a szerv körüli kötőszövetnél vagy az ereknél (l. felfüggesztések[7]) fogva mozgatjuk anyagunkat.

Ne fixáljunk a kelleténél nagyobb tömegű szövetet! Ha szükséges, az adott szervből igen éles eszközzel vágjunk ki egy megfelelő nagyságú darabot, és ezt helyezzük a fixálóba. Ezzel megnyitjuk a szerv kötőszövetes tokját, amivel megkönnyítjük a rögzítőszer behatolását.

Végül ügyeljünk arra, hogy a rögzítő mennyisége sokszorosan haladja meg a fixált szerv térfogatát! Gondoljunk arra, hogy ellenkező esetben a szövetmintából kiáramló anyagok (pl. vér) jelentősen megváltoztatják a fixáló oldat összetételét és ezzel rontják a rögzítés minőségét (a rögzítőszer és a minta kölcsönösen hatnak egymásra).

A rögzítésnek a minta bomlását megakadályozó szerepén túl még az is fontos sajátossága, hogy megkeményíti a szervet vagy a szervrészletet, és így megkönnyíti a metszet készítését.

A rögzítéssel kapcsolatos tudnivalók

Rögzítő- vagy fixálószerek

Már régóta alkalmazott és ma is az egyik legjobb fixálószer a formaldehid (formol, HCOH), amely a hangyasav (acidum formicum) aldehidje. A mintába gyorsan behatoló és csak kevéssé zsugorító formalint általában 4-5%-os vizes oldatként alkalmazzuk. Az izotóniás és pufferelt formalinban (neutrális formalin) a formalinoldathoz kálium-dihidrogénfoszfát és dinátrium-hidrogénfoszfát keverékét tartalmazó puffert (l. Sörensen-puffer) adunk.

A rögzítőhöz adott pufferoldatok úgynevezett hordozó oldatok, amelyekkel az in vivo körülményeket (pH, ionösszetétel, ozmotikus viszonyok) igyekszünk utánozni, pótolni (zsugorodás, kioldódás, anyagvesztés megakadályozása). Alkalmazásuknak akkor van nagy jelentősége, amikor a vizsgált komponensek (pl. fehérjék) alakjának és aktivitásának megőrzése elsődleges szempont (l. immunhisztokémia és enzimhisztokémia), vagy kiértékelésünket ultrastrukturális szinten végezzük (l. elektronmikroszkópia).

Nagy előnye a formalinos rögzítésnek, hogy az optimális rögzítési időt túllépve sem történik baj, sőt évekig, évtizedekig formalinban tárolt anyagokból is jó minőségű fénymikroszkópos metszet készíthető.

Az elektronmikroszkópos minták előkészítésére csak korlátozottan alkalmas, mivel az általa létrehozott keresztkötések reverzíbilisek, azaz a rögzítő kimosásakor jelentős részük felbomlik (ultrastrukturális szinten ez anyagok elmozdulását, kioldódását teszi lehetővé). A formaldehid további tulajdonságaira az elektronmikroszkópos technikák kapcsán térünk ki (l. később).

A formalin mérsékelten rákkeltő és egészségkárosító is, szaga szúrós és kellemetlen. Ezt a vele való munka során érdemes észben tartani.

Az alkohol ugyancsak jó rögzítőszer. Igen gyorsan penetrál, rövid időn belül átjárja a szervet, viszont erőteljes vízelvonó szer, ezért zsugorítja a mintát. Leggyakrabban e célra etanolt (CH3CH2OH, EtOH) alkalmazunk, de az izopropil-alkohol is megfelelő.

Megjegyezzük, hogy a szövettani technikában az alkohol volt az egyik első rögzítőszer, használatát Johann Christian Reil vezette be.

Rögzítőkeverékek

Tökéletes rögzítőszer nincsen, ezért manapság elsősorban rögzítőkeverékeket alkalmazunk. Ebben az egyes komponensek előnyös sajátosságai összeadódnak, hátrányos tulajdonságaik pedig mérséklődnek.

A Bouin[8]-keverék, amely igen elterjedt és szép eredményt adó rögzítőszer, formalint, jégecetet (tömény ecetsav) és pikrinsav-oldatot tartalmazó, az utóbbi komponens miatt sárga színű keverék. (Összetétele: 71% telített pikrinsav-oldat, 24% tömény formalinoldat és 5% jégecet, készítését l. a Függelékben). Hátránya többek között az, hogy a pikrinsavat ki kell mosni a mintából, ami idő- és oldószerigényes. A metszetekben visszamaradt pikrinsav festődési problémákat, egyenetlenségeket okoz. A rögzítőszer kimosása 80%-os alkohollal történik, amit mindaddig cserélünk a mintán, amíg az alkohol már nem sárgul el (ez rövid időközönkénti, sokszoros oldatcserét jelent). Alternatív megoldásként választhatjuk azt a lehetőséget, hogy a blokkban bennmaradt pikrinsav maradékot a beágyazás után, a festés előtt távolítjuk el a metszetekből. Ez anyag- és időtakarékos megoldás.

A Carnoy[9]-keverék (60% etanol, 30% kloroform és 10%-nyi jégecet; készítését l. a Függelékben) valamennyi komponense gyorsan penetrál, így a fixálási idő rövid, ami előnyös lehet. Ugyanakkor zsugorító hatású. Ennek ellenére egyes sejtalkotók, így pl. a sejtmagvak struktúrája Carnoy-rögzítés után nagyon szép. A rögzítőszert 80%-os alkohollal mossuk ki.

A rögzítés módjai

Egy adott szerv rögzítésekor nemcsak a fixálóoldat összetételét, hanem a rögzítés módját is meg kell határoznunk. Alapvetően két módszer közül választhatunk.

Az immerziós fixálás során a helyéről óvatosan kiemelt szervet a rögzítő többszörös térfogatú oldatába merítjük. Gondoskodnunk kell arról, hogy minden oldalról rögzítőszer vegye körül, azaz lehetőleg lebegjen a folyadéktérben, de ne ússzon annak felszínén. Egyes szervek esetében ez utóbbi elkerülése a szerv levegő tartalmának eltávolítását igényli. Ha ez nem lehetséges (pl. egy tüdő esetében), akkor egy nehéz, a rögzítőt tartalmazó edény aljára süllyedő tárgyhoz (pl. egy üvegdugóhoz) horgonyozhatjuk a szervet. A mintát lazán gézlapba csomagoljuk, a gézlap csúcsait összekötjük, majd ehhez rögzítjük megfelelő hosszúságú cérnával az üvegdugót.

Az immerziós fixálás előnye, hogy nem igényel különösebb felszerelést. Hátránya, hogy a rögzítőoldat a rögzítés előrehaladtával egyre lassabban hatol be a mintába, hiszen a felszínt egyre jobban fixálja, annak átjárhatóságát ezzel önmaga számára is csökkenti. Számolnunk kell tehát azzal, hogy a felszíni rétegek jobb megtartásúak lesznek, mint a minta belseje. Nagyon fontos tehát a rögzítendő szervdarabka méretének megfelelő megválasztása!

A másik eljárás a perfúziós fixálás. Ennek során a rögzítőt a túlaltatott állat érrendszerébe juttatjuk, s annak közvetítésével „belülről” fixáljuk a szervet. Mivel szinte minden szerv tartalmaz ereket, az eljárást általánosan használhatjuk.

Az adott állat érrendszerének ismeretében és a szerv helyzetétől függően kiválasztunk egy megfelelő átmérőjű artériát, amelybe kanült vezetünk. Ha a fixálandó szerv a nagy vérkörhöz tartozik, akkor – egér vagy patkány esetében – a kanült legcélszerűbb a bal szívkamrába vezetni úgy, hogy annak hegye az aorta kezdetébe felérjen (2.16. ábra). A vénás rendszer megnyitása után fiziológiás sóoldattal átmossuk az ereket, majd a kimosó oldatot lecseréljük a fixálóra. (Így a rögzített vér nem zárja el az ereket.) A folyadékok megfelelő sebességű áramoltatásáról vagy a folyadéktartályok adott magasságban való elhelyezésével (gravitációs mozgatás), vagy egy perisztaltikus pumpa segítségével gondoskodhatunk. A megnyitott vénás rendszerből kicsöpögő folyadékok számára elvezetést biztosítunk.

A szívet a bal oldali rajzon piros körrel vettük körül. A jobb oldali ábrán a fiziológiás sóoldattal töltött edény kék, a fixálószerrel töltött flakon sárgás színű.

2.16. ábra. Perfúziós fixálás vázlatrajza: az elaltatott állat mellkasát feltárjuk (A), a szívburkot felnyitjuk, a bal kamrán metszést ejtünk, amelyen keresztül a kanült bevezetjük az aortába (B)

Az eljárás akkor vezet szép eredményhez, ha a munkát a túlaltatást követően azonnal megkezdjük, lehetőleg akkor, amikor az állat szíve még működik, s a keringése még nem állt le. A perfúziót követően a szervet óvatosan kiemeljük a helyéről. Bár kevésbé sérülékeny, mint a fixálás előtt, de a fentebb említett szabályok betartására ekkor is szükség van!

A perfúziós eljárás előnye, hogy a szervet annak helyén rögzítjük, és azelőtt, mielőtt még hozzányúltunk volna. Ezzel nagymértékben csökkenthetjük a mechanikai roncsolásból adódó műtermékek képződését. Mivel a rögzítőszer az érrendszer felől érkezik a sejtekhez, s az érrendszer behálózza a szervet, a fixálás a szerv teljes területén azonnal megkezdődik, s nem kell számolnunk a gyengébb penetrációból adódó hátrányokkal (egyenetlen rögzítés).

A két eljárást kombinálhatjuk is: a perfúziós rögzítést követően alkalmazhatunk immerziós utófixálást. Ezt kifejezetten ajánljuk akkor, ha ultrastrukturális szinten vizsgálódunk (l. elektronmikroszkópia).

A rögzítés hőmérséklete

Rutincélokra és gyors eredmény szükségessége esetén kielégítő a szobahőmérsékleten végzett rögzítés.

Ha kíméletesebb eljárásra van szükség (pl. elektronmikroszkópos eljárásban vagy immunológiai módszer alkalmazása előtt), az immerziós rögzítést végezhetjük 4°C-on is. Ez ugyan meghosszabbítja a rögzítés idejét, de mivel lassítja a fixáló penetrációját, az abból adódó káros hatásokat (pl. zsugorodás) csökkenti. Megfelelő összetételű fixálókeveréket alkalmazva a minta hűtőszekrényben hosszabb ideig is eltartható a „túlfixálódás” veszélye nélkül.

A megfelelő ideig rögzített anyagból ezután kimossuk a fixálószert. Amennyiben a rögzítőkeverékben vizes oldatok szerepeltek, a kimosás történhet csapvízzel vagy 80%-os etanollal (fénymikroszkópos minta készítésekor), illetve a fixáló hordozóoldataként alkalmazott pufferoldattal (fény- és elektronmikroszkópos minták esetében egyaránt).

Metszetkészítés beágyazás nélkül

Fagyasztó mikrotommal készített metszetek

Ezzel az eszközzel általában pufferelt formalinban fixált szervekből szoktunk metszeteket készíteni. A vizsgálat célja a gyors diagnózis felállítása pl. műtétek közben kivett (biopsziás) anyagokból. Alkalmazhatjuk olyan komponensek kimutatása során is, amelyek a hagyományos, beágyazással járó eljárások során kioldódnak vagy sérülnek: ilyenek pl. a lipidek (membránok, membránkötött molekulák vizsgálata) és enzimek (l. hisztokémiai eljárások).

A módszer előnye a paraffinos beágyazott anyagokból készített metszetekkel (lásd alább!) szemben az, hogy igen rövid időn belül hozzájuthatunk az eredményhez, a lipidek a metszetből nem oldódnak ki (l. víztelenítés), és az enzimek aktivitása is kevésbé sérül, mint a paraffinos beágyazási eljárás során (itt a víztelenítés és a magas hőmérséklet okoz problémát).

Az eljárás hátránya, hogy ezzel a módszerrel nem lehet olyan vékony metszeteket készíteni, mint egy beágyazott blokkból, és a festhetőség is korlátosabb.

A metszés előtt a metszendő anyagból lassan áramló vezetéki vízzel kimossuk a formalint, majd a szervet a fagyasztó mikrotom tárgytartójára helyezzük, ami rendszerint egy Peltier[10]-elem. Ez az eszköz hőszállításra képes félvezetőkkel működő szerkezet, amely pl. fagyasztó mikrotom tárgyasztalkájáról a készüléken átáramló vízhez vezeti el a hőt, és ezzel a tárgyasztalt lehűti, és az azon lévő szervet pedig megfagyasztja. A metszésre szánt anyaghoz kevés vizet adunk, így a fagyasztást követően a mintánk jégbe fagy, mintegy beágyazódik. A víz a gyors lehűtésnek köszönhetően folyadék állapotban fagy meg, nem képez kristályokat, így nem roncsolja a sejteket.

Ezután megkezdhetjük a metszést. A késtartóba helyezett speciális, e célra készített késsel a metszetvastagságot kb. 10–15 µm-re állítjuk, a kést közepes gyorsasággal mozgatjuk. A metszés közben a kés mozgatásával nem szabad megállni.

A metszet általában felcsúszik a kés felületére, ahonnét azt megnedvesített ecsettel szedjük le, majd pufferbe vagy desztillált vízbe helyezzük (l. 2.29. ábra). Kellő számú metszet összegyűjtése után a metszeteket ecsettel rakjuk tovább a soron következő vegyszerbe vagy festékoldatba. Az eljárás végeztével a metszeteket tárgylemezre helyezzük, majd pl. glicerinnel lecseppentve és fedőlemezzel lefedve vizsgáljuk (l. lefedés).

Ha tartós készítmény előállítása a cél, akkor felszálló alkoholsorozattal és xilollal víztelenítenünk kell. A víztelenített metszeteket tárgylemezre helyezzük, és kanadabalzsammal vagy valamilyen szintetikus lefedőszerrel és fedőlemezzel fedjük (l. lefedés).

A fagyasztó mikrotom használatakor egy mélyfagyasztott (kb. -25 °C) szervet metszünk egy szobahőmérsékletű késsel. A fennálló hőmérsékleti különbségből adódóan kellő felbontást biztosító vékony metszet csak nehezen és bizonytalan eredménnyel készíthető. A problémát kriosztát használatával küszöbölhetjük ki.

A kriosztát vagy kriotom

A kriosztát egy mélyhűtött térbe (azaz mélyhűtőpultba) helyezett mikrotom, amelyet az eszköz oldalán elhelyezett forgatható kerék és a kezelőpanel gombjainak segítségével tudunk működtetni (2.17. ábra). A kriosztátban a metszendő anyag és a kés egyforma hőmérsékletű, így jó rögzítést követően rutinszerűen készíthetünk 5 µm vastagságú metszeteket is. A metszetek kezelése és a metszetkészítés céljai megegyeznek a fagyasztó mikrotomnál leírtakkal.

a felső képen a berendezés messzebbről látható, az oldalai szürkésfehérek, a teteje lépcsős kialakítású. Ennek hozzánk közelebbi felszínét átlátszó üveglap képezi. Jobb oldalán a nagy, forgatható keréknek fekete fogantyúja van. Az alsó képen az üveglap alatti, beépített mikrotom látható, amely sötét, és fémesen csillog.

2.17. ábra. Kriosztát: a berendezés külső oldalai (A) és beépített mikrotomja (B)

A vibratom vagy rezgőkéses mikrotom

Az eszköz natív állapotú vagy fixált anyagok metszésére szolgál. A metszendő anyagot pl. agaróz gélbe ágyazzuk, és így ragasztjuk fel a tárgytartóra, amely egy pufferrel vagy desztillált vízzel megtöltött medencében foglal helyet, a folyadékszint alatt (2.18. ábra). A rezgő kés által leválasztott metszetek a folyadék tetején kisimulnak, festésig itt gyűjtjük össze őket.

A folyadékot tartalmazó kis medence a kép közepén sötéten tűnik elő. Ebben egy fémszűrke tálca van, amiben áttetsző víz látható, amely ellepi a világosbarna szervdarabkát. Utóbbi a kép alsó részén, a középvonalban található nagy, fekete gomb fölött van.

2.18. ábra. Vibratom: a készülék kése egy Gilette-penge, amelynek befogóját egy rezgő karra erősítették. A metszendő szervdarabka és a penge a folyadékszint alatt vannak, a metszetek a folyadék felszínére úsznak fel

Az eljárás előnyei részben egyezőek a fagyasztó mikrotomos technikáknál leírtakkal, azaz nem kell a szövetmintát vízteleníteni, a beágyazás során különböző vegyszerekkel átitatni és meleg (56 °C-os) paraffinba ágyazni. Ezért az eljárás jól használható hisztokémiai reakcióknál, immunfestéseknél, azaz ott, ahol a molekulák eredeti konformációjának megőrzése nélkülözhetetlen.

A hátrányok is hasonlóak a fagyasztó mikrotomos technikánál említettekkel, azaz a szabadon úszó metszetek kezelése kissé nehézkesebb, mintha azokat tárgylemezre „ragasztottuk” volna, illetve nem lehet olyan vékony metszeteket készíteni, mint egy beágyazott blokk esetében.

Megjegyzendő azonban, hogy a neuroanatómusok előszeretettel használják, mivel az így készített vastagabb metszetek alkalmasak arra, hogy egy idegsejt kapcsolatrendszerét áttekintsük, azaz kisebb neuronális hálózatokat egyben vizsgáljunk. A vastagabb metszetben a mikroszkóp mikrocsavarjának használatával (az élesség síkjának állításával) egy határig követhetjük az idegsejtek nyúlványainak lefutását, és meghatározhatjuk esetleges kapcsolataikat.

Metszetkészítés beágyazással

Ez a leggyakrabban alkalmazott szövettani technika, amellyel vékony, 3–10 µm vastagságú metszetek készíthetők egyenként és sorozatban is. A metszetek festésére, az egyes komponensek kimutatására rendkívül sokféle módszer áll rendelkezésünkre. A metszetek korlátlan ideig tárolhatók, könnyen kezelhetők.

A beágyazás menete

A rögzítőszer kimosását követően anyagunkat felszálló alkoholsorozatban (50%, 70%, 80%, 90%, 96%-os és abszolút etanol) dehidráljuk. Elsősorban a beágyazandó anyag méreteitől függ, hogy mennyi ideig tartjuk szövetmintánkat ezekben az oldatokban. Ugyanakkor, ha a mintánk túl sokáig van alkoholban, akkor túlzottan megkeményedik, és metszése nehezebb lesz. Fontos, hogy az oldószerek térfogata a beágyazandó szerv térfogatának többszöröse legyen, másképpen az alkoholok kihígulnak.

Sürgős munka esetén, a rutinvizsgálatokra szánt mintáknál a víztelenítést elegendő 70%-os etanollal kezdeni. Ha az ütemezés úgy kívánja (pl. munkaszüneti napok miatt), a víztelenítési eljárásba hosszabb „pihenőt” is beiktathatunk, de a mintát csak a 70-80%-os alkoholban hagyhatjuk több napig állni.

Az utolsó, vízmentes etanolból anyagunkat többször váltott benzolba, toluolba vagy metilbenzoát-celloidin keverékbe helyezzük át. Minden egyes áttételnél az előző oldószer maradványait röviden leitatjuk. A fent említett szerek úgynevezett intermedierek, ami azt jelenti, hogy az abszolút alkohollal és a beágyazószerrel is problémamentesen elegyednek. Amennyiben a víztelenítés nem sikerült és az anyagban víz maradt, akkor az intermedier kissé megzavarosodik. A kezelések idejét elsősorban a szervdarabka mérete határozza meg. A leírásokban ajánlott időket érdemes pontosan betartani, hiszen ezen lépésekkel az a célunk, hogy az intermedier a mintát tökéletesen átitassa. Ugyanakkor az idő túlfutása az anyagot nagyon megkeményítheti (2.19. ábra).

A baloldalon kerek, a jobb oldalon négyszögletes üvegedényben vannak a szervek. A bal oldali szerv narancssárga, a jobb oldali sötétbarna. A jobb oldali ábrán az intermediaer színtelen maradt.

2.19. ábra. Intermedierrel átitatott minták (bal oldalon gyomor, jobb oldalon feldarabolt földigiliszta; a bal oldali szervet Bouin-fixálóval rögzítettük, s a víztelenítés előtt nem távolítottuk el teljes mértékben a pikrinsavat, aminek egy része beoldódott az intermedierbe)

A beágyazószerek alkalmasak arra, hogy a mintát folyékony állapotukban átitassák, s megszilárdulva annak metszéséhez megfelelő támasztékot adjanak. Ezek olyan anyagok tehát, amelyek magasabb hőmérsékleten megolvadnak, azaz folyadékok, lehűtve pedig megdermednek. A jó beágyazószerrel szemben követelmény, hogy megdermedéskor ne változzon a térfoga, azaz ne okozzon torzulást, s ne lépjen reakcióba a szövettel.

Régebben az általánosan használt beágyazószer a méhviasszal kevert paraffin volt: a méhviasz lágyította az önmagában rideg, törékeny paraffint. A laza szerkezetű szövetek azonban gyakran zsugorodnak a paraffin olvadáspontja (54–56 °C) körüli hőmérsékleten, s ennek kiküszöbölésére később azt celloidinnel keverték (l. az intermedierek között a metilbenzoát-celloidin keveréket). (Ha csak celloidinbe ágyaznánk a vizsgálandó anyagot, akkor nem tudnánk olyan vékony metszeteket készíteni, mint a paraffinos keverék esetén[11].)

Ma már a paraffin helyett szintetikus utánzatokat használnak, mint amilyen a Paraplast[12]. Mivel lényegileg paraffin, a köznapi szóhasználatban gyakran nevezik paraffinnak (a két elnevezés csereszabatos).

A rutineljárás során a beágyazást tehát 56°C-os termosztátban végezzük. Az intermedierből kivett szervet – a megfelelő idők betartásával –az intermedier–beágyazószer 2:1, majd 1:1, és végül 1:2 arányú keverékébe tesszük, s a termosztátban tartjuk.

Ezután a mintát meleg, termosztátban tartott csipesszel a tiszta beágyazószert tartalmazó edénybe helyezzük. Ez az ún. 1. számú, más néven előparaffin/előparaplaszt. A mintában még jelenlévő intermedier kiáramlik a beágyazószerbe, azaz eltávozik a szervből. A második, ún. kiöntőparaffinba/paraplasztba így már olyan anyag kerül, amely nyomokban sem tartalmaz intermediert (2.20. ábra).

A fényképen csiszolt dugós, áttetsző üvegedények és jobbra egy fehér porcelán tálka látható. Az edények fehér szűrőpapíron állnak, barna háttér előtt.

2.20. ábra. A beágyazáshoz termosztátban előkészített oldatok és eszközök

Amennyiben visszagondolunk a leírtakra, akkor láthatjuk, hogy az eljárás során a mintában lévő vizet vagy vizes oldatokat fokozatosan alkoholra, majd az alkoholt intermedierre, végül az intermediert beágyazószerre cseréltük ki. A végeredmény egy olyan szerv, illetve szervrészlet, amelynek minden kis tere kitöltődött a beágyazószerrel.

A még olvadt kiöntőparaffinban lévő szervet meleg csipesszel eligazítjuk, a későbbi metszésre gondolva kellő helyzetbe állítjuk (orientáljuk) azért, hogy a metszés síkját egyértelműen meg tudjuk határozni. Ezután az edényt kiemeljük a termosztátból, és jégkockás vízfürdőben, vagy mélyhűtőpultban gyorsan lehűtjük, megdermesztjük. A megolvasztott kiöntőparaffint célszerű olyan műanyag sablonokban, vagy porceláncsészében tartani, amelyekből majd a fagyott, dermedt paraffinblokkot könnyedén el lehet távolítani. A hűtés hatására a paraplasztblokk felszíne elválik a kiöntőformától, így abból könnyen kiütögethető. A kiesett formából a felesleget le kell faragni, hiszen a beágyazott anyag valahol annak belsejében van. Gyakori, hogy egy kiöntőformába egyidejűleg több mintát is beágyazunk, így ezeket most önálló blokkokká kell alakítanunk. A beágyazószer feleslegét késsel vagy szikével távolíthatjuk el úgy, hogy közben a szervdarabkát magába foglaló anyagból hasábot formálunk. Ez a beágyazott mintát tartalmazó blokk.

Végezetül a paraffinblokkot olvadt paraffincseppel felragasztjuk egy fakockára (2.21. ábra), amit ezután befoghatunk a mikrotom tárgybefogójába. Ezzel anyagunk metszésre készen áll.

A képen barna színű fakockákon fehér színű, téglalap alakú blokkok látszanak, közepükön sárga szervdarabokkal.

2.21. ábra. Fakockára ragasztott paraplasztblokkok: a bal oldali blokk felszínén látszik, hogy ebből már metszet is készült (a szervek Bouin-fixálóból visszamaradt pikrinsav miatt sárgák)

Automatizált beágyazás

Ahol nagy mennyiségű mintát kell feldolgozni, és fontos a gyorsaság is (l. diagnosztika), ott a víztelenítést és a beágyazást automata vagy félautomata gépekkel végzik.

A víztelenítőberendezésekben olyan tartályok helyezhetők el, amelyekben nagy mennyiségű minta kezelhető egyszerre (2.22. ábra). Annak érdekében, hogy ezeket meg lehessen különböztetni, a szervdarabokat (biopsziás mintákat) kis kazettákba helyezik, amelyekre az azonosító adataikat is ráírják (2.23. ábra). A kazettákat kosarakba teszik, majd ezt az első tartályba helyezik. A gépek programozhatók, a mintatartó kosarakat automatikusan töltik fel a víztelenítés során használt oldatokkal, s megadott idő elteltével önállóan helyezik át azokat egyik tartályból a másikba. A sor végén a tiszta beágyazószerrel feltöltött tartály áll, amelyből az azzal átitatott szerveket tartalmazó kazettákat kiveszik és termosztátba helyezik.

A bal oldali berendezés kék színű, a jobb oldali fehér. Utóbbi talpazatán szűrke, henger alakún nagy fülű edények állnak körben: ezekben történik a minták kezelése.

2.22. ábra. Víztelenítőautomaták: régebbi (A) és újabb (B) típus

A beágyazás itt is kézi munka. A beágyazógépekben van egy folyékony beágyazószert tartalmazó tartály, amelyből egy kis csap lóg a munkaterület fölé. A csapot gombnyomással kinyitjuk, s egy megfelelő méretű, fém beágyazótálkát félig megtöltünk beágyazószerrel. A mintatartó kazettát felnyitjuk, a tetejét eldobjuk, majd a szervdarabkát csipesszel óvatosan átemeljük a folyékony beágyazószerbe. Ekkor van lehetőség a minta orientálására, amit csipesszel végzünk. Ezután a mintatartó kazetta azonosító adatokat hordozó alját ráfordítjuk a fém beágyazótálkára, azaz a mintára, s teljesen feltöltjük a kis tálkát a beágyazószerrel.

Az előtérben a laboráns fehér kesztűje uralja a képet. E fölött a jobb kezében fémcsipeszt tart, a fehér, kis beágyazó kazettát a bal kézfeje fölött, a kép középső részén látjuk. A kazettában a szerv sötétbarna.

2.23. ábra. Beágyazógép munkapadja: a beágyazás kezdetén a fém beágyazótálka félig víztiszta beágyazószerrel töltött, s éppen a minta kazettából való kiemelését látjuk

A kész blokkot a gép munkapadján kialakított hűtött felületre helyezzük, ahol az hirtelen lehűl, így a blokk a fémtálkából könnyen kifordíthatóvá válik. A kész, beágyazott blokk azonosítható, hiszen az egyik oldalán ottmarad az azonosító jeleket hordozó félkazetta (2.24. ábra). Mivel ez nagyobb, mint a fémtálka, alkalmas arra is, hogy a fakocka szerepét betöltse, azaz rögzíthető egy mikrotom blokkbefogójába (2.25. és 2.26.ábra). A fémtálka leemelése után a kazettát a talpára állítva látható, hogy ebben az esetben nincs szükség a blokk befaragására, mivel a beágyazott minta a tálka alakjának megfelelő csonka piramis belsejében van.

A mintatartó kazetták kékek, rajtuk a paraplaszt réteg áttetsző, a benne lévő minták kicsik és sárgák.

2.24. ábra. Automata géppel beágyazott minták: a blokkok alján a mintatartó kazetta alja látható (az azonosítószámok a hátsó oldalon), a tetejükön a mintákat magukba foglaló, a fémtálka alakjának megfelelő kiemelkedések (a fekete jelölések utólag megjelölt minták)

A mikrotomok és a metszés

A mikrotomok fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatokra alkalmas metszetek készítésére kifejlesztett eszközök.

Az első mikrotomot Purkinje[13], kiváló cseh tudós alkalmazta még a XIX. században. Ez idő előtt a kutatók általában alkoholban keményített anyagot metszettek az akkori idők legélesebb eszközeivel, borotvákkal. Ezek a metszetek változó vastagságúak és minőségűek voltak. A mikrotomok bevezetésével a metszetkészítésnek ez a mozzanata óriásit javult, ezzel együtt és ezért is megindult a festési eljárásokat forradalmasító kutatás is. Az első sorozatban gyártott mikrotomokat a Reichert cég készítette Ausztriában.

A mikrotom két alapváltozata a szánka- és a kerekes (Minot-féle) mikrotom. Míg a fénymikroszkópos vizsgálatokra beágyazott, 3–10 µm vastagságú metszetek készítésére mindkét típust használják, addig az elektronmikroszkópos technikában, az ún. ultravékony metszetek készítésére csak az utóbbi típus terjedt el (l. ultramikrotom). A paraplasztos metszetek kézzel is készíthetők, az ultravékony metszetek készítése azonban már automatizálást igényel.

A szánkamikrotom

Ennek a mikrotomnak az alsó részében egy igen simára megmunkált és olajozott, hosszúkás csúszófelület van. Az ebbe illeszkedő szánka ezen a felületen csúszik el. A szánka a rászerelt késtartóval együtt fogantyúján keresztül mozgatható (2.25.A ábra). Az alsó részre van felszerelve a fakockára felragasztott paraffinblokk befogására alkalmas tárgytartó, amelyhez mikronnyi léptékkel működő emelőszerkezet tartozik (2.25.A–C ábra). Amikor a szánkát alaphelyzetbe, azaz magunktól ütközésig eltoljuk, az emelőszerkezet a tárgytartót a beállított mértékben és értékkel megemeli (2.25.C ábra). A szánka magunk felé húzásával a kés a paraffinblokkba hatolva elkészíti a metszetet.

A felső képen a zöld mikrotom szürke háttér előtt áll. A középső fénykép a blokk és a fakocka befogó szorítóját mutatja. Az alsó felvételen ugyanezt a részt látjuk alul/oldalnézetben. A mikrotom zöld, a tárgybefogó és a kés fémszürke, a blokk fehér, benne a szerv sárga színű.

2.25. ábra. Szánkamikrotom: a kés mozgatásának irányát a metszet lehúzása közben a B ábrán piros nyíl jelzi

A kerekes vagy rotációs mikrotom

A szánkamikrotommal ellentétben ezekben a berendezésekben a kés áll, és a tárgytartó mozog a hozzá rögzített blokkal együtt. A metszés során egy kerék hajtásával idézzük elő a tárgytartó le és felfelé történő mozgását, és így készítjük a metszeteket (2.26. ábra). Ez a mikrotomtípus különösen alkalmas sorozatmetszetek készítésére, de csak akkor, ha a beágyazásunk jól sikerült.

A felső képen az eszköz jobb oldalán a hajtókerék látható a fekete foganytúval. Az alsó fotón a tárgytartót és az üres késbefogót látjuk közelről: ezek fémszürkék. A kép közepén az áttetsző blokk látható.

2.26. ábra. Modern kerekes mikrotom: a késbefogó még üres, de a blokkot már rögzítették a metszéshez: utóbbin látszik, hogy automatával végzett beágyazás során készült, hiszen a blokkbefogóba a mintatartó kazetta alja rögzül (az A ábrán látható, hogy a késbefogó felénk néző oldalán beosztás van, tehát az dönthető)

A mikrotomokhoz használt kések (mikrotomkések) élei különböző kialakításúak – annak megfelelően választunk közülük, hogy milyen tulajdonságú blokkot (beágyazott anyagot) kell metszenünk (2.27. ábra).

A keresztmetszeti rész sötéten árnyalt, a kés kontúrjait vékony vonallal ábrázoltuk.

2.27. ábra. Mikrotomkések különböző késprofiljai

A mikrotomkéseket a számukra gyártott dobozban tartjuk (2.28.A ábra), s csak a metszés idejére vesszük elő. Rendkívül élesek, nagyon komoly sérülést okozhatnak! A velük való mindenfajta tevékenység nagy figyelmet igényel!

A metszés során a kések éle kopik, illetve sérül, ami a metszetek roncsolódásához vezet. Ha azt tapasztaljuk, hogy a kés csíkot húz a metszeten, akkor azt újra kell éleztetni (2.51. ábra). Ezt a feladatot csak erre képzett szakemberre bízzuk!

Manapság általában cserélhető pengékkel dolgozunk, amelyeket egy mikrotomkést utánzó befogóba rögzítünk, így az gond nélkül beilleszthető a mikrotom késbefogójába (2.26. ábra). Amikor ez a penge tönkrement, lecseréljük. A blokkok mechanikai tulajdonságainak megfelelően különböző pengék kaphatók, így választhatunk a kemény, a közepesen kemény és a lágy blokkok (anyagok) metszésére ajánlott pengék közül.

A felsorolt tárgyak világoskék háttér előtt láthatók. Felül a fémszürke kés világosbarna fadoboban van. Ez előtt kék dobozka tartalmazza a cserélhető pengéket. A mikrotom kés és a cserélhető pengét befogó tartó fémszürke.

2.28. ábra. Mikrotomkések (A, C) és cserélhető pengék (B, D): mikrotomkés dobozban (A) és szabadon (C), cserélhető pengék adagolódobozban (B), és egy cserélhető penge a hozzá tartozó, kést utánzó befogóban (D)

A metszés kivitelezése hasonló ahhoz, amit a fagyasztó mikrotomos metszésnél már leírtunk. A blokkot a kés síkjához igazítjuk a beállítócsavarok és szorítók segítségével, s ellenőrizzük, hogy a metszendő anyag felszíne a kés pengéjével párhuzamosan áll-e. A késsel óvatosan közelítjük meg a blokkot, majd egy nem gyors, de határozott mozdulattal, megállás nélkül lemetsszük az anyagot. Ha az első metszet nem tartalmazza az egész blokkot, akkor igazítunk a blokk pozícióján. Az anyag mechanikai tulajdonságainak megfelelően állíthatunk a kés dőlésszögén is (2.26.A ábra).

A metszet rendszerint felcsúszik a kés felszínére. Ezt célszerű a metszet lehúzása közben finom, megnedvesített ecsettel segítenünk (2.29. ábra).

A kép központi részét a szürke kés és a barna fakockára ragasztott, áttetsző blokk foglalja el, a barna szőrszálakból álló ecset a kép felső szegélyéről, jobbról nyúlik a kép közepébe.

2.29. ábra. Metszés közben a metszet felcsúszik a kés felszínére, ahonnan ecsettel lehet óvatosan leemelni

A kés felszínéről leemelt metszetet ezután annak tapadását növelő anyaggal, pl. tojásfehérje glicerinnel bekent, vagy polilizinnel[14] bevont tárgylemezre cseppentett desztillált vízre helyezzük. Ezen a metszet kiterül, de kisebb-nagyobb gyűrődések még maradhatnak benne. Ezért a tárgylemezt egy kb. 30 °C-os melegítőlapra helyezzük, ahol a metszet gyűrődései kisimulnak, egyben a víz elpárolog, a metszet pedig rögzül a tárgylemez felületére (2.30. ábra).

A kék oldalú, fekete tetejű asztalkától balra barna metszettartó dobozban sorakoznak az elkészült, festett és festetlen metszetek.

2.30. ábra. Az elkészült metszetek melegítőasztalon száradnak

Amikor sorozatmetszeteket kell készíteni, azaz egy tárgylemezre több egymást követő metszetet is fel kell vinni, akkor az egymás után lemetszett metszeteket nem választjuk szét. Ezek szomszédos élükkel összetapadnak, így egy egységben le is emelhetők a késről (2.31. ábra).

A kép fekete-fehér, a jobb felső sarkában a laboráns arcának árnyékban lévő, sötét részlete látható. A kép bal térfelén a legfeltűnőbb, világos, fehér folt a blokk felszíne és a késről lelógó, egymáshoz kapcsolódó metszetek sorozata.

2.31. ábra. Összetapadt sorozatmetszetek a kés felszínén

Kisimításukhoz vízfürdőt használunk: a meleg víz tetejére helyezett metszetek adott időn belül szépen kinyújtóznak. Tárgylemezre úgy telepíthetők, hogy a lemezzel alájuk nyúlunk, az egyik sorvégi metszetet ecsettel a tárgylemezhez szorítjuk, majd a sorozatot óvatosan kiemeljük a vízből (2.32. ábra).

A kép fekete-fehér. Baloldalt a fehér köpenybe öltözött laboráns, a jobb alsó sarokban a metszetek kisimítására használt vízfürdő látható.

2.32. ábra. A sorozatmetszetek vízfürdő segítségével húzhatók fel egy tárgylemezre

Az azonosíthatóság miatt fontos, hogy kóddal vagy írással minden egyes tárgylemezt megjelöljünk. Az adatoknak tartalmazniuk kell azt, hogy a tárgylemezen milyen szervek miféle metszetei (metszési sík) találhatók, esetleg dátummal együtt. A manapság forgalomban lévő tárgylemezeken – a lemez egyik végén – maratással erre megfelelő helyet alakítanak ki. Arra azonban figyeljünk, hogy olyan írószert használjunk (pl. gyémánt hegyű ceruza), aminek nyomát a későbbi (alkoholos) kezelések nem mossák le , illetve hogy a tárgylemeznek a metszettel azonos oldalára írjunk (ezzel megelőzhetjük a metszet letörlését akkor, amikor az szabad szemmel nem látható)!

Metszeteinket a szárítást követően lehetőleg számozott helyekkel rendelkező metszettartó dobozokba helyezzük, és festésig itt tartjuk őket, nehogy beporosodjanak.

A szövettani metszetek festése

A szövettani festékek olyan anyagok, amelyek különböző mértékben kötődnek a sejtek, illetve szövetek egyes komponenseihez. Vannak közöttük olyanok, amelyek a szövetek szinte minden eleméhez kötődnek, igaz, nem azonos intenzitással jelölik azokat. Az ilyen festékeket általános tájékozódásra használhatjuk. A festékek másik csoportja specifikusan csak egy-egy összetevőhöz kötődik, így annak kimutatására használhatjuk.

Általában nem egy, hanem több festékkel festünk egy metszetet. A festékeket használhatjuk keverékben (anilinkék+orange-G az Azan-festésben) vagy egymás után (pl. hematoxilin-eozin festés).

A festék mutathatja a saját színét: a jelenség neve ortokromázia. Előfordulhat azonban, hogy más színben látjuk viszont a metszeten: ez a metakromázia (pl. az anilinkék kék szín helyett zöldre festi a rugalmas rostokat).

A festés típusa lehet progresszív, amikor a festődést a festés idejével szabályozzuk. A regresszív festés esetében a festékkel túlfestjük a metszetet, azaz azt telítjük vele, majd utána a nem kötődő felesleget egy megfelelő oldószerrel kimossuk, eltávolítjuk.

A szövettani metszetek festése e célra szolgáló sima vagy (a tárgylemezek összetapadásának megakadályozása miatt) bordázott belső felületű üvegedényekben, úgynevezett küvettákban történik (2.33. ábra). A festendő metszetek számának és a rendelkezésre álló oldatok mennyiségének megfelelően választunk közülük. Bármelyiket használjuk is, mindig figyeljünk arra, hogy az egymás mellé állított tárgylemezeknek az azonos oldalán legyenek a metszetek (azonos orientáció), illetve hogy az így sorakozó, szomszédos lemezek ne tapadjanak össze!

Fehér háttér előtt bal oldalon és középen áttatsző üvegedények, jobb oldalon zöld műanyagból készült küvetta, előtte szürke tárgylemeztartó keret látszik.

2.33. ábra. Álló és fekvő üveg, valamint tárgylemeztartó betéttel rendelkező műanyag küvetta

A hematoxilin-eozin festés

Ez a legrégebbi szövettani festési eljárások egyike, egyben a legjobb és a legszélesebb körben használt módszer, mivel teljes áttekintést ad a metszetről. Több változata ismert (l. Függelék). Az eljárással kitűnően festődnek a sejtmagvak és a citoplazma, és számos granuláció is feltűnik. Valamennyi általánosan használt rögzítőszer után alkalmazható.

A paraffinos metszeteket első lépésként kétszer váltott xilolban deparaffináljuk, majd leszálló alkoholsorozatban (abszolút etanol, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%-os etanol) egészen desztillált vízig visszük el. A desztillált vizes küvettából alkoholos, kissé savanyított hematoxilin (haematoxylin) oldatba tesszük át metszetünket, amivel magfestést végzünk.

A hematoxilint a börzsönyfa vagy kékfa (Haematoxylum compechianum) nevű növényből állítják elő. A mikrotechnikában az oldatnak több változata is ismert (pl. hemalaun, vas-hematoxilin), amelyek alapvetően a festékanyaghoz kevert fémsókban (alumínium vagy vas) térnek el egymástól[15] (l. Függelék). A metszeten adott színükben és esetleg a festés jellegében is eltérőek (l. pl. vas-hematoxilin, 2.34. és 2.35. ábra).

A bal oldalon a hámréteg felszíne balkéz felé esik, a képen számos fekete sejtmag látható. A jobb oldalon az izomszövet markáns sajátossága, a fekete csíkokból kirajzolódó harántcsíkolat látszik.

2.34. ábra. Vas-hematoxilinnel festett metszet: hámréteg (A) és harántcsíkolt vázizomszövet (B)

A festés után a metszetünkből desztillált vízzel kimossuk a felesleges festéket, majd küvettával együtt rövid időre csapvízbe helyezzük. A csapvízben lévő szervetlen anyagok hatására a sejtmagvak szép kékeslilára színeződnek.

Ezután újabb desztillált vizes öblítés, majd eozinfestés következik. Az eozint vízben és alkoholban is oldhatjuk. A keramikusok által is gyakran használt eozin (eosin, magyarul: hajnalpír) a citoplazmát pirosas színben tünteti fel, de kötődik az extracelluláris térben lévő kollagénhez is. A felesleges festéket az alkalmazott eljárástól függően vagy desztillált vízzel, vagy alkohollal kimossuk (a használt oldat típusa attól függ, hogy az eozint vizes vagy alkoholos oldatként használtuk-e), végül felszálló alkoholsorozatban víztelenítünk. Ezután kétszer váltott xilol következik, majd a metszetet a küvettából kivéve kanadabalzsammal, vagy valamilyen szintetikus lefedőszerrel és fedőlemezzel lefedjük (2.35. ábra). (Részletes eljárást a Függelékben közlünk.)

A hámszövet felszíne a kép jobb alsó sarka felé tekint.

2.35. ábra. A hematoxilin-eozin festés végeredménye: a sejtmagok liláskékek, a citoplazma és a sejtközötti állomány komponensei rózsaszínek-pirosak (emlős tüdő, bronchiolus)

Megjegyezzük, hogy mindkét festék általános festék, azaz a sejtmagokhoz és a citoplazmához is kötődnek. Ha megnézzük a metszetet a hematoxilinfestés után, vagy csak eozinnal festjük meg, akkor ez nyilvánvaló. A két festék kombinációja azonban mégis egymást kiegészítő képet ad: a hematoxilin a nukleinsavakban (sejtmagok, DER), az eozin pedig a fehérjékben gazdag területeket jelöli jobban (2.36. ábra).

A muscularis kisartéria keresztmetszete az első esetben kékes, majd rószaszínű, végül rózsaszínű alapon kékesen pettyezett lesz. Az ér lumenében összecsapódott, rózsaszínű vörösvérsejtek vannak.

2.36. ábra. Párhuzamos metszetek festődése hematoxilinnal (A), eozinnal (B) és a két festék együttes alkalmazásával (C) (emlős, izmos falú kisartéria)

Az eozinofil kifejezés azt jelenti, hogy az adott struktúra erősen köti az eozint: ez arra utal, hogy fehérjében gazdag. Minél nagyobb tehát egy sejt citoplazmájának fehérjetartalma, annál intenzívebben festődik eozinnal. Fordítva, ha egy sejt citoplazmatere alig tartalmaz fehérjét, akkor az a sejt alig festődik, a mikroszkópban ezért világosnak látjuk. A jelenség jól látható, ha pl. fehérje- és nyálkatermelő mirigysejtek állományát hasonlítjuk össze (2.37. ábra).

A kép bal oldalán a sötétlila, tömör szerkezetű részt a fehérjében gazdag, a jobb oldali világosabb, lazább szerkezetű részt pedig a nyálkában gazdagabb váladékot termelő sejtek alkotják.

2.37. ábra. Összetett nyálmirigy részlete: a sötétebben festődő sejtek fehérjetartalmú, a világos citoplazmájúak pedig nyálkatartalmú váladékot halmoznak fel a citoplazmájukban (a metszeten műtermékképződés is látható, pl. szakadások formájában)

Az Azan-festés

Az Azan egy rövidítés, és a festék két fő komponensére: az azokárminra és az anilinkékre utal.

A módszer élénk kék színben tünteti fel a kötőszöveti alapállományt és a kollagénrostokat, valamint egyes nyálkaanyagokat (ezekhez az anilinkék kötődik), továbbá rózsaszínre festi a sejtek citoplazmáját és vörösre a sejtmagvakat (ez utóbbiakat az azokármin festi, 2.38. ábra).

A festés során még egy harmadik festéket is alkalmaz(hat)unk: ekkor a festést trikróm (három színnel való[16]) festésnek nevezzük. Az Azan-festés esetében a leggyakrabban ez az orange-G festékoldat, amelyet az anilinkékkel keverünk össze (a keverék neve Mallory-oldat). Az orange-G narancssárgára festi az emlősök vörövértestjeit.

A dehidrálás lépéseit nem ismételjük meg, a többi vegyszeres kezelés áttekintése és a lépések magyarázata meghaladja ezen anyag kereteit (l. Függelék). Az azonban megjegyzendő, hogy ez a festés kötőszöveti állományok általános kimutatására használatos.

A felvétel középső részén a kékre festődő porcállomány és a perichondrium uralja a területet.

2.38. ábra. Azan-festés eredménye: a kötőszövet és a porcszövet kék, a sejtmagok vörösek, a sejtek citoplazmája piros (törpeharcsa kopoltyúja, kopoltyúlemez a kopoltyúsugárral)

A toluidinkék festés

Ez egy egyszerű, de hasznos festési módszer, amelyet formalinban végzett fixálást követően alkalmazunk. A festékoldat toluidinkéket tartalmazó alkoholos oldat. A metszet festődése sokszor metakromáziát mutat, ami egy porcszövet esetében azt jelenti, hogy az interterritoriális állomány zöldeskék, a porcudvarok mélykékek, a porcsejtek liláskékek lesznek, azaz a festődött részek színe eltér a festék színétől. Az eljárás jól használható fejlődéstani metszetek festésére, porcok feltüntetésére, a porcszerkezet tanulmányozására és félvékony metszetek festésére (l. elektronmikroszkópia).

A Golgi-festés, Golgi-impregnáció

Louis Ranvier vezette be az ezüstsók alkalmazását a szövettanba, és Camillo Golgi volt az, aki az első olyan módszert dolgozta ki, amellyel az idegsejteket nyúlványrendszereikkel együtt lehetett feltüntetni. A róla elnevezett Golgi-impregnációnak óriási jelentősége volt, Golgi Nobel-díjat kapott Santiago Ramón y Cajallal együtt, 1906-ban. A Golgi-módszernek számos módosítása ismeretes, pl. a Cajal-féle. Golgi saját módszerét fekete reakciónak (olaszul: reazione nera) nevezte.

A szövetdarabot formalinos fixálást követően vizes kálium-dikromát-oldatban tartjuk, majd ebből az oldatból kivéve a mintát leitatjuk és vizes ezüst-nitrát-oldatba helyezzük. Ezt követően az anyagból kb. 20 µm vastagságú és nem nagy felületű metszeteket készítünk. A metszeteket etanollal dehidráljuk, felderítjük, azaz átlátszóvá tesszük, majd lefedjük és vizsgáljuk. Az eljárásban az idegsejtek felszínére ezüst-kromát csapadék, illetve kristályok válnak ki, amelyektől a neuronok teljes nyúlványrendszere feketésbarna színnel rajzolódik ki. A háttér is barna lesz (2.39. ábra).

A kép közepén látható idegsejt és a nyúlványok sötétbarnák, a háttér kissé világosabb barna.

2.39. ábra. Golgi-impregnációval festett idegszövet (oldalsó térdes test, corpus geniculatum laterale, CGL)

Egyszerű idegrostfestési eljárás

Az alábbiakban a legegyszerűbb rostkötegfestési eljárást írjuk le. Formalinos fixálást követően az idegszövetből fagyasztó mikrotommal 20–25 µm vastagságú metszeteket készítünk, majd ezeket desztillált vizes kimosást követően ozmium-tetroxid (OsO4) oldatba helyezzük, egészen addig, amíg a metszetek közép-dohánybarnára színeződnek. A barnás színeződést az ozmium redukciója okozza. Ezután a felesleges ozmium-tetroxidot kimossuk, a metszeteket dehidráljuk, xilolban kezeljük, végül tárgylemezre húzzuk őket, lefedő anyagot cseppentünk rájuk, és eligazításukat követően fedőlemezzel fedjük.

Egy hagyományos méretű tárgylemeznél nagyobb agyrészből is készíthetünk metszeteket, de ilyenkor nagyobb felületű tárgylemezt és fedőlemezt kell alkalmaznunk. A festést követően a metszetek teljes felülete barna lesz, de a rostkötegek és pályák (pl. a corpus callosum, a fornix, a commissura anterior, a tractus olivocerebellaris[17]) feketésbarna színnel tűnnek elő. Különböző sejtcsoportok (pl. az oliva inferior, vagy a középagy substantia nigra nevű magja) is jól előtűnnek (2.40. ábra). A kisebb sejttesttel rendelkező neuronok nem jelölődnek kellőképpen. A módszer természetesen nem alkalmas egy-egy konkrét pálya szelektív festésére; ehhez kísérletes módszerekre van szükségünk, de jól alkalmazható az agytörzs struktúráinak tanulmányozására és bemutatására.

A metszet egésze feketésbarna, világosabb és sötétebb területekkel.

2.40. ábra. Idegrostfestési eljárás végeredménye emberi nyúltvelő metszeten: a rostok feketés-barnák, közöttük az idegsejtcsoportok (magok, l. oliva inferior) világosabb területek

A Luxol Fast blue-krezilibolya festés

Formalinban történt fixálást követően az idegrendszeri mintát paraffinba ágyazzuk, majd 5–7 µm vastagságú metszeteket készítünk. Deparaffinálást és hidratálást követően – ez utóbbival csak a 96%-os etanolig megyünk el – anyagunkat meleg (56 °C-os) termosztátban Luxol Fast blue oldatban festjük, majd a felesleges festéket 96%-os etanollal kimossuk (regresszív festés). Egy lítium-szulfátos és alkoholos kezelés következik, majd ezután mikroszkóp alatt megvizsgáljuk készítményünket. Ha a velőállomány (fehérállomány) erősen kéklik, a kéreg viszont halványkék, és ha a két rész között a határ éles, akkor jól dolgoztunk.

Ezután következik a krezilibolya festés, majd metszetünket dehidráljuk és lefedjük (részletesen l. Függelék). A rostok kék, illetve zöldes színűek, a sejtek liláskékek. A módszer igen szép és szabatos áttekintést nyújt az idegszövet struktúrájáról (2.41. ábra).

A fényképen kékre festődő, kis idegrost átmetszetekből álló formációk láthatók, ezek között rózsaszínes lilásan tűnnek elő az idegsejtek és a náluknál kisebb glia sejtek.

2.41. ábra. Luxol Fast blue-krezilibolya festés eredménye: az idegsejtek perikarionjainak sejtmagja, magvacskája, a citoplazma szemcsézettsége (Nissl-rögök), a vastagabb nyúlványok és a glia sejtek rózsaszín-lilás színük miatt jól elkülöníthetők a kék velőhüvelyes rostoktól (agytörzs)

Hisztokémiai eljárások

Amikor a sejtek, szövetek valamilyen makromolekuláris összetevőjét szeretnénk kimutatni, akkor azt azok jellege alapján választott hisztokémiai eljárásokkal tehetjük meg. A hiszto- vagy szövetkémia célja a sejtek, szövetek kémiai felépítésének és az alkotóelemek lokalizációjának feltárása. (Amennyiben ez kizárólag a sejt szintjére vonatkoztatott, a cito- vagy sejtkémiai elnevezést használjuk.)

A hisztokémiai reakciók alapja mindig egy olyan kémiai vagy biokémiai reakció, amely alkalmas a makromolekulák vagy funkcióik azonosítására. Az átalakítások akár többlépéses reakciósorok is lehetnek, amelyek mechanizmusa részben vagy egészben feltárt. Az eredmények általában kvalitatív (minőségi), ritkábban kvantitatív (mennyiségi) jellegűek.

A szűkebb értelemben vett, vagy más néven leíró hisztokémián a sejtek, szövetek makromolekuláit (fehérjék, poliszacharidok, nukleinsavak, lipidek), illetve anorganikus alkotóelemeit közvetlenül kimutató, direkt eljárásokat értjük.

Ezzel szemben a funkcionális hisztokémia a sejtek és szövetek működéséről, a bennük végbemenő folyamatokról ad felvilágosítást, indirekt eljárások útján. Enzimeket ismert reakciómechanizmusuk alapján mutathatunk ki (l. enzimhisztokémia), egyedi fehérjéket pedig immunológiai módszerrel.

A makromolekulákat kimutató, direkt eljárások közül az alábbiakban az úgynevezett PAS festést és egy lipidfestést mutatunk be röviden, az enzimhisztokémia köréből pedig a lúgos és savas foszfatázok kimutatásával foglalkozunk. Az immunológiai módszereket jelentőségük miatt külön fejezetekben tárgyaljuk (l. immunhisztokémia, immuncitokémia).

A PAS-festés

A PAS szintén egy betűszó (perjódsav: periodic acid és Schiff-reagens). Nem általános festés, hanem meghatározott szöveti komponensek kimutatására szolgál. A festésre szánt mintát pikrinsavas rögzítőkeverékkel (pl. Bouin-rögzítő) vagy neutrális formalinoldattal rögzítjük.

A módszer glikogén, proteoglikánok és nyálkaanyagok, mukopoliszacharidok kimutatására való, és így pl. kitűnően festi a bélbolyhokban lévő nyálkatermelő kehelysejtek váladékát, az alaphártyát, a porcok alapállományát, a rugalmas rostokat és a nyálmirigyekben a nyálkatermelő (mucinosus) végkamrákat. A festődő struktúrákat PAS-pozitívnak nevezzük.

Az eljárás során az említett makromolekuláris anyagokban lévő alkoholos csoportokat perjódsavval aldehiddé oxidáljuk, majd az aldehideket a fukszint tartalmazó úgynevezett Schiff-reagenssel mutatjuk ki. A metszeten való tájékozódást megkönnyítendő, a sejtmagvak láthatóvá tételére úgynevezett ellenfestést alkalmazunk, így a szövettani képen a világoslila PAS-pozitív részletek között a sejtmagvak is megjelennek (2.42. ábra).

Az eljárást kombinálhatjuk egy harmadik festékkel is, pl. a kötőszöveti állomány láthatóvá tétele érdekében (trikróm festés).

A felvétel középső része a fehérje termelő mirigyek tömege miatt világos festődésű, a PAS pozitív, lila részek a bal és a jobb szélen foglalnak helyet.

2.42. ábra. PAS-festés eredménye: a kehelysejtek váladéka és egyes kötőszöveti elemek PAS-pozitívak, élénklilák, míg a fehérjetermelő sejtek PAS-negatívak, áttetszőek (a magfestést alciánkékkel végeztük, hal kopoltyúja)

Lipidek kimutatása

Lipidek kimutatásához formalinban fixált, fagyasztott vagy fixálatlan és fagyasztó mikrotommal vagy kriosztáttal készített metszeteket használunk. A fagyasztással itt a beágyazás procedúráját kerüljük ki, mivel az azzal járó víztelenítés során (az alkoholsor nagyobb koncentrációjú tagjai miatt) a lipidek egy része távozik a szövetből.

Metszeteinket desztillált vízben gyűjtjük össze, majd kalciumtartalmú formalinban utófixálunk, ha formalinos anyaggal dolgozunk. (A kalcium-ionok jelenléte stabilizálja a membránok szerkezetét.) Ezt követően a metszeteket propilén-glikolban merítjük, majd azokat Szudán-fekete oldattal megfestjük. Festés után ugyancsak propilén-glikolban kiöblítjük a felesleges festéket (regresszív festés). Ezután a magvakat Kernechtrottal festjük pirosra, végül készítményünket glicerinben fedjük le (részletesen l. a Függelékben).

A reakcióval a telítetlen észterek és a trigliceridek kékesfeketére színeződnek, a foszfolipidek szürkés színben jelennek meg, míg a velőhüvelyekben lévő lipidek a polarizációs mikroszkópban bronz árnyalattal tűnnek elő.

Általánosan használt lipidfesték az Oil red is. A fixálást itt is neutrális formalinnal vagy kalciumtartalmú formalinnal, a metszést (a beágyazás elkerülése végett) pedig fagyasztó mikrotommal érdemes végezni. A festéket izopropil-alkoholban oldjuk, a magokat hematoxilinnal festjük (l. Függelék). Ezzel az eljárással a lipidcseppek narancsszínűek, a magok kékek lesznek. A 2.43. ábrán ilyen módon festett, sejttenyészetben tartott sejteket mutatunk be.

A sejtek halványszürkék fehér háttér előtt, a bennük lévő lipidcseppek narancssárgák.

2.43. ábra. Oil red festés sejttenyészeti sejteken: a lipidcseppek narancssárga pöttyökként tűnnek elő a citoplazmában (hematoxilin magfestés, kínai törpehörcsög petefészek (CHO) sejtek)

Enzimhisztokémiai reakciók

Ezek az eljárások azon alapszanak, hogy a minta- vagy metszetkészítés során alkalmazott procedúra ellenére a preparátumban maradnak ép, működőképes enzimek, ezek megfelelő körülmények között aktiválhatók, és szubsztrátjuk hozzáadásával oldhatatlan, színes csapadékot képeznek. Ennek helye az enzim jelenlétét bizonyítja, illetve lokalizációját jelzi.

Az eredmények csak megfelelő kontroll mellett fogadhatók el, mivel az eljárás számos műtermék-képződési lehetőséget rejt (az elégtelen fixálás miatt az enzimet nem az in vivo előfordulási helyén mutatjuk ki, a rossz fixáló, az enzimaktivitást biztosító körülmények nem megfelelő volta, vagy a keletkező csapadék kioldódása, elmozdulása miatt téves negatív eredményt kaphatunk). Kontrollok lehetnek olyan metszetek, amelyeken mindent ugyanúgy végzünk, mint a többi metszeten, de 1) nem adunk hozzá szubsztrátot, vagy 2) hozzáadjuk az enzim specifikus gátlószerét, vagy 3) a szubsztrát hozzáadása előtt hővel kezeljük a metszetet (denaturáljuk az enzimet). Ezen kezelések eredményeképpen nem kapunk aktivitást.

Lúgos foszfatáz kimutatása Gömöri szerint

A Gömöri György által kidolgozott nehézfémsós módszerek a szubsztrátumról lehasított foszfát- vagy szulfát-ionok láthatóvá tételén alapulnak.

A foszfatáz nevű enzimek szerves foszfátésztereket hasítnak, a lúgos foszfatázok pH-optimuma pH 9-nél van.

A kimutatásra szánt anyagot (szervet vagy szövetmintát) kalciumot tartalmazó formalinoldatban fixáljuk[18], majd fagyasztott vagy paraffinos metszeteket készítünk belőle. (Az utóbbi esetben ügyeljünk arra, hogy a beágyazás során csak a minimálisan szükséges hőnek tegyük ki a szövetet, nehogy az enzimet inaktiváljuk.) Amennyiben paraffinos metszettel dolgozunk, a deparaffinálást követően hidratáljuk a metszetet (fagyasztott metszetek esetében ez szükségtelen), majd nátrium-glicerofoszfátot tartalmazó nátrium-veronálacetát pufferben inkubáljuk őket. A reakció során az enzim a nátrium-glicerofoszfátból hasítja le a foszfátcsoportot, amely az inkubálóoldatban és a szövetben lévő kalcium-ionnal (ez az úgynevezett lecsapó reagens) kalcium-hidrogénfoszfát (CaHPO4) csapadékká alakul.

Mivel azonban a CaHPO4 színtelen, ezért kobalt (II)-sókkal és ammónium-szulfiddal ((NH4)2S) reagáltatva kobalt-szulfidra (CoS) cseréljük le.

Első lépésben a színtelen csapadékban a kalciumiont kobaltionra cseréljük: CaHPO4 + Co2+ → CoHPO4 + Ca2+, majd második lépésként a foszfátcsoportot szulfiddal helyettesítjük: CoHPO4 + S → CoS + HPO4.

A kobalt-szulfid markáns kékesfekete színű és rosszul oldódó csapadék, amely jelzi az enzim jelenlétét. A metszeten való tájékozódást megkönnyítendő magfestést végzünk, pl. hemalaunnal (a magok kékek lesznek). Végül vizes kimosást követően glicerinben átderítjük a metszeteket, és ugyancsak glicerinben le is fedjük őket (2.44.A ábra). (Az eljárást részletesen l. a Függelékben.)

Savas foszfatáz kimutatása Gömöri szerint

A savas foszfatázok pH-optimuma 5 körüli érték. A savas foszfatázok kimutatása abban különbözik a fentiektől, hogy a lehasított foszforsav-maradékot ólom (Pb) ionokkal kötjük meg.

Anyagunkat formalinban vagy formalingőzben fixáljuk, majd fagyasztó mikrotommal vagy kriosztáttal metszeteket készítünk belőle. Ezután ólom-nitrátot és nátrium-glicerofoszfátot tartalmazó és a megfelelő pH-t biztosító nátrium-veronálacetát pufferben inkubáljuk a metszeteket. Az enzim a nátrium-glicerofoszfátról, azaz a szubsztrátumról lehasítja a foszfátcsoportot, amely ez esetben is láthatatlan. Ólomionokkal ólom-hidrogénfoszfátot (PbHPO4) képez. A következő ammónium-szulfidos inkubáció arra való, hogy a foszfátcsoportot szulfidcsoportra cseréljük le. A reakció eredményeképpen kialakuló barnásfekete ólomszulfid csapadék (PbS) jelzi a keletkező foszfátionok és ezzel az enzim helyét (2.44.B ábra).

A savas foszfatáz az egyik legjellemzőbb lizoszomális enzim.

A Gömöri-módszert elektronmikroszkópos szinten is lehet alkalmazni, hiszen mind a kobalt-szulfid, mind pedig az ólom-hidrogénfoszfát elektronszóró. (A részletes eljárást l. a Függelékben.)

A bal oldali képen több egysejtű látható, bennük a sejtmag világosabb köralakú területként, a lizoszómák ennél jóval kisebb és erősen festődő, fekete pontokként jelennek meg. A jobb oldali képen a csapadék vastag, fekete sáv, alatta a sejtek halványlilák.

2.44. ábra. Lúgos (A) és savas (B) foszfatáz kimutatása: a reakció következtében primer lizoszómák és táplálékvakuolumok jelölődtek Tetrachymena sejtekben (A), valamint csapadék jelenik meg a vesetubulusok hámjának kefeszegélyén (a magfestés hematoxilinnal történt, B)

A félvékony metszetek

A paraplasztba ágyazott metszetek több sejtsornyi vastagok. Az úgynevezett félvékony metszetek ennél vékonyabbak, körülbelül egy sejtréteget tartalmaznak. Az elnevezés magyarázata, hogy az ilyen metszetek vastagságukat tekintve (ami 1–1,5 µm) a fény- és az elektronmikroszkópos (úgynevezett ultravékony) metszetek között foglalnak helyet. Éppen olyan vastagok, hogy fénymikroszkóppal még vizsgálhatók, azaz annyi festék még meg tud kötődni bennük, hogy a preparátum látható legyen.

Előállításukat, mivel az a fénymikroszkópia területén használt módszerektől némileg eltérő elektronmikroszkópos minta-előkészítési eljárást igényel, az elektronmikroszkópiával foglalkozó fejezetben mutatjuk be.

A lefedés

A festést a preparátum tartósítása érdekében lefedés követi. Erre azért is szükség van, mert a fénymikroszkópok optikai rendszere úgy kerül kialakításra, hogy kellően részletgazdag és jó minőségű kép csak a tárgy és fedőlemez együttes használatával kapható.

A lefedőszerek egy része vízoldékony, más része xilolban oldódik. Az utóbbiak esetében a festés során metszetbe került vizet el kell távolítanunk. A metszetet ilyenkor egy felszálló alkoholsor oldataival kezeljük, amit váltott xilolos öblítés követ.

A lefedés menete a következő: az oldószerből kivett tárgylemezt megtörölgetjük, a rárakódott festéknyomoktól megtisztítjuk. Gyorsan kell dolgoznunk, hiszen a xilol gyorsan párolog, s ha nem igyekszünk, akkor a metszet kiszárad. A megtisztított lemezre a metszet mellé egy csepp lefedőszert cseppentünk. A fedőlemezt a csepp széléhez érintve letámasztjuk a tárgylemezre: ilyenkor a csepp szétfut a két lemez érintkezési vonala mellett. Ezután a fedőlemezt egy vékony tűvel (gombostű, bonctű, esetleg csipesz) megtámasztjuk, majd lassan leengedjük a tárgylemez felszínére (2.45. ábra). Biztosítsunk elegendő időt arra, hogy a lefedőszer a fedő- és a tárgylemez között szétterjedhessen, s csak a terjedés ütemében engedjük le a fedőlemezt. A kész metszetet száradni hagyjuk (a lefedőszer megszilárdul), majd feliratozzuk és metszettartó dobozba helyezzük.

A jól lefedett metszet buborékmentes, a lefedőszer mennyisége éppen elegendő arra, hogy kitöltse a teljes fedőlemez alatti területet, azaz nem folyik ki a fedőlemez szélén. Az így elkészített metszetek hosszú ideig színváltozás nélkül eltarthatók.

A tárgylemez halványkék, a festett metszet annak középtáján található, narancssárga-barna színösszetételű. A lefedőszer rózsaszínű.

2.45. ábra. A festett metszet lefedése: a lefedő anyag egy cseppjét a metszet mellé cseppentjük (A), egy fedőlemezt a csepp mellé a tárgylemezre támasztunk (B), majd tűvel megtartva óvatosan leeresztjük (B ábra, kék nyíl). A kész metszetet hagyjuk megszáradni, majd feliratozzuk (C)

Metszeteken látható néhány gyakori műtermék

Ebben a fejezetben a szövettani metszeteken látható leggyakrabban előforduló műtermékeket foglaljuk össze. Az itt bemutatott hibák komolyan nem zavarják a metszeten való tájékozódást, sőt, ha ismerjük keletkezésük okát, akkor a megjelenésük még a metszet értelmezéséhez is hozzásegíthet bennünket. Az ilyesfajta műtermékek előnyei ellenére azonban törekednünk kell arra, hogy ezek képződését megelőzzük, hiszen célzott vizsgálatoknál már akadályai lehetnek a kísérlet kiértékelésének. E téren a mikrotechnikával foglalkozó könyvek és leírások igen sok hasznos tanácsot adnak.

Egy szerv kiemelése során gyakran előforduló hiba, hogy azt rögzítőbe helyezése előtt nem öblítjük le megfelelő oldatban (fiziológiás sóoldat vagy pufferoldat). Ez akkor szükséges, ha a szerv kiemelésével ereket is átvágunk, s azokból a vér a szerv külső vagy (ha az üreges) belső felszínére folyik. Ezt azután a rögzítő odafixálja ahhoz a felszínhez, ahol vér élő állapotban soha nem volt (2.44. ábra). Az ilyenfajta műtermék felismerése szövettani ismereteket igényel, hiszen tudnunk kell, hogy az a tér, amelyben a vért látjuk, nem a keringési rendszer része (pl. nem ér).

A légcső rétegei mindkét fotón rózsaszínűek. A bal oldali képen a kép jobb és bal oldalán műtermékként megjelenő vér piros.

2.46. ábra. Példa a szövettani eljárás során keletkező műtermékre: a légcső belső és külső felszínén megjelenő vér (A), valamint műtermék nélküli, nyálkaréteggel bevont belső felszín (B)

Gyűrődések ott és akkor keletkeznek, ahol a különböző összetételű szövetek az előkészítés során eltérő mértékben és/vagy irányban zsugorodnak, s a metszéssíkban „hosszfölösleggel” rendelkező réteg felgyűrődik (2.47.A, B ábra). Gyűrődések a nagyméretű metszeteken homogén szöveti állományon belül is megjelenhetnek. Ennek oka az, hogy a szövet a metszés során helyenként jobban megnyúlhat, mint a környezete (2.47.C ábra).

A gyűrődések környezetüknél sötétebb vonalakként jelennek meg.

2.47. ábra. Gyűrődések keletkezése: a különböző szöveti összetételű rétegek a metszés során eltérő módon nyúlnak meg, a megnyúlt részek ráncokat képezve felgyűrődnek (aortafal, A; gyomor, B); gyűrődés szívizomszövetben (C). (Mindhárom metszet hematoxilin-eozin festésű)

A nagy fehérjetartalmú folyadékok (l. vér, vérplazma) vagy váladékok a mikrotechnikai eljárás során nagyon tömör tartalommá állhatnak össze. Metszéskor ez azt eredményezi, hogy az érintett területen egymással párhuzamos, vastagságbeli (ebből következően festődésbeli) egyenetlenségek, esetleg hasadások jelennek meg benne (2.48. ábra). Ilyen jelenséget vázizomszövetben is megfigyelhetünk a citoplazma magas akto-miozin-tartalma miatt (2.48.E ábra).

A metszetben a markáns és nagy felületű színes területek a mirigysejtek, a közöttük lévő jóval kisebb színes, kerek átmetszetek a mirigysejtek közötti szövet sejtjeinek magvai.

2.48. ábra. Éticsiga köpenyszegélyének részlete mirigysejtekkel: a sávos festődés és a töredező beltartalom a fehérjetermelő mirigysejteket jelzi (Azan festés)

A metszeten megjelenhetnek egymással párhuzamosan rendeződő, szabálytalan alakú, de ismétlődő szakadások. Hámmal borított felszínekről a hámréteget metszés közben a kés letolhatja ott, ahol az nem rögzül elég stabilan az alatta lévő felszínhez. Szakadásokat megfigyelhetünk intenzíven elszarusodó laphám rendezett rétegei között, de tipikusak orientált kollagénrostokat tartalmazó szövetben is. Itt az egymás mellé rendeződő rostokat nem kapcsolják össze kovalens kötések (ennek okát l. a szövettani tankönyvekben), s a kötőszöveti állomány két oldalán lévő szövetek zsugorodása a rostokat széthúzza (2.49.C–D ábra).

Minden fotó színes.

2.49. ábra. Tipikus műtermékként megjelenő szakadások: hám leválása (A), rések az elszarusodó laphám rétegében (B), szakadások orientált kollagénrostokat tartalmazó kötőszövetben (C, D) és izomrostok burkaiban (E). (A szakadásokat fekete és kék nyilak jelzik; az E részleten látható fekete nyílhegyek az izomrostok citoplazmájában keletkező hasadásokra mutatnak. A C ábrán Azan-, a többin hematoxilin-eozin festés látható)

A metszetből hiányozhatnak szabályos alakú struktúrák: mire a megfestett, kész metszetet megnézzük, azt tapasztaljuk, hogy egyes részei „kiesteka környezetükből. Ez akkor fordulhat elő, amikor az adott metszés síkjában a hiányzó részlet éppen önálló, nem kapcsolódik a környezetével, s egyébként nem tapad elég szorosan a tárgylemez felszínéhez. Amikor a festés előkészítéseként a beágyazószert eltávolítjuk, az utolsó köteléket is kivonjuk a metszetből, ami egy ilyen részletet a helyén tartana. Egy hosszú ideig tartó festés (pl. Azan-festés) során ezek a területek leválnak, „leáznak” a tárgylemezről (2.50. ábra).

A szőrtüsző ürege kiterjedt, kerekded térként a kép közepén jelenik meg, a nevezett faggyúmirigy állománya ez alatt látható, finoman pöttyözött, benne a sejtmagok sötét foltok. Az „üres” szőrtüszőtől balra egy szőrszálat tartalmazó szőrtüsző figyelhető meg, benne a szőrszál sárga.

2.50. ábra. A szőrtüszőből kiesett szőrszál helye, amely a faggyúmirigy szőrtüszőbe torkollása magasságában már nem tapad szorosan a gyökérhüvelyhez (hematoxilin-eozin festés)

A mikrotomkés éle a használat során sérül. Keletkező késhibára elsősorban akkor lehet számítani, amikor olyan szöveti állományt metszünk, amely vagy eredendően, vagy a fixálásból és víztelenítésből következően kristályos szerkezetű, nagy rendezettségű részletet tartalmaz. Ilyen pl. a csontszövet, az elmeszesedő porc, a kollagénrostokban gazdag tömött rostos kötőszövet.

A kés élének sérülése miatt az egymás után lehúzott metszeteken mindig ugyanazon a helyen jelenik meg az apró szakadások sora (késcsík), vagy esetleg nagyobb terület kitörése, kiszakadása (2.51. ábra).

Ez már a metszéskor, a még festetlen metszeten is jól látható. Ha cserélhető pengével dolgozunk, a befogóba tegyünk be új pengét, illetve a különböző blokkok metszésére ajánlott pengék közül válasszuk a kemény anyagokhoz ajánlottat. Hagyományos mikrotomkés esetében az egyetlen megoldás az éleztetés.

Átmenetileg, ha nagyon szükséges, akkor a munkát a sérült késsel is folytathatjuk, ha a blokk elforgatásával a sérülés olyan területre esik, ahol már nincsen metszendő anyag. Ezzel azonban újabb hibákat idézünk elő a kés élében, csak ezúttal másik helyen, így végül is csak egy vagy két további ép metszet készítésére van lehetőségünk.

A porc és a kötőszövet kék színű, a törések és a szakadások ezek állományában található fehér terek és csíkok.

2.51. ábra. A halkopoltyú metszetén a kés az él hibája miatt nem metszi, hanem kitöri a kopoltyúsugarakban lévő keményebb porcszövetet (zöld nyílhegy, A, B), a lágyabb szövetekbe pedig csíkot húz (A, B, C). (A B ábrán a kitört és részben áthelyeződött, elhajlott részt zöld körvonalú nyílhegy mutatja. Mindhárom felvétel törpeharcsa kopoltyújának részletét mutatja Azan-festéssel)

A késhiba miatt részben kiszakadt szövetrész már nem tapad le a tárgylemezre úgy, mint a környezete. Amikor a festett metszetet vizsgáljuk, azt tapasztaljuk, hogy annak bizonyos részlete(i) a metszet síkja fölött „lebeg(nek)”. Amikor ez a terület éles, a környezet életlen, és fordítva (2.52. ábra). Az elemelkedett részek ugyanúgy vizsgálhatók, mint a környezet, de lehetetlenné teszik a nagyobb nagyításon való fényképezést.

A fotókon kék és piros színezetű metszetek láthatók. A metszet síkjából kiemelkedő részlet a jobb oldali képen középtájon látható, fekete nyílhegyek veszik körül, amelyek rámutatnak.

2.52. ábra. A túl kemény anyagot (itt csontszövetet) a kés kiszakította a környezetéből, ezért az a metszet többi részétől elemelkedett: az A képen a környezet éles, a B képen a kiszakadt rész (Azan-festés, hal kopoltyúja)

Amikor azt tapasztaljuk, hogy a festett metszet egyes részei alig vagy egyáltalán nem láthatók, akkor két lehetőséget kell végiggondolnunk. Az egyik az, hogy az adott részlet megfestésére nem a megfelelő festéket használtukmás szavakkal: az alkalmazott festék nem vagy alig festi a kérdéses részletet. Ilyen gyanú esetén érdemes más festékeket kipróbálni. A másik lehetőség, hogy a festéknek nem volt mit megfesteni, azaz ez a részlet hiányzott (hiányzik) a metszetből. Ennek oka lehet nem megfelelő fixálást követő kioldódás és késhiba is.

A nyálkaanyagok különböző összetételűek, s ez meghatározza azt, hogy milyen körülmények (pH) között melyik mikrotechnikai festékkel mutathatók ki (pl. anilinkék /Azan-festés/, PAS- vagy alciánkék festés). Közös jellemzőjük, hogy viszonylag kis fehérjetartalmuk miatt eozinnal gyengén festődnek. Ennek hátterében azonban részben az is állhat, hogy egy részük a metszet készítése során kioldódik (2.53.A ábra).

A rutineljárás során a lipidek ugyancsak kioldódnak. Így a zsírszöveti sejtek lipidcseppjei helyén üres (fehér) területet látunk, míg a cseppek körüli citoplazma és a sejtmag kirajzolódik (2.53.B ábra). A velőshüvely speciális lipideket tartalmazó, helyenként igen vastag axonborítás. A mielin anyagának kioldódása miatt a velőshüvelyű rostok keresztmetszetén a neuriteket ugyan látjuk (ezek apró pöttyök), de ezeket nem velőshüvely, hanem csak egy „üres” (fehér) gyűrű veszi körül (2.53.C ábra).

A bal oldali felvételen a bal felső részben mucinosus végkamrájú és fehéres színben mutatkozó mirigyállomány, alul és jobbra sötétebbre festődő serosus állomány látható. A középső képen a kioldódott lipidek helyén „üres” területek jelennek meg. A C ábrán a gerincvelői fehérállományban a kis pontokat, azaz az axonokat fehér gyűrű, azaz a lipidjeit vesztett myelin hüvely veszi körül. A felvétel bal szegélyén a barnásra festődött szürkeállományban két nagyobb neuron barna, csepp alakú sejtteste látható.

2.53. ábra. Eltérő összetételű váladékot termelő mirigyvégkamrák festődése eozinnal (A), porcsejtekből kioldott lipidcseppek helye (nyilak, B) és a mielin kioldódása miatt megjelenő fehér udvarok tömege idegpályák axonjai körül (C)



[7] A testüregekben a szerveket savós hártya által képzett felfüggesztések rögzítik a helyükön, illetve az ér- és az idegrendszer is ezeken keresztül éri el a célszerveit.

[8] ejtsd: buen

[9] ejtsd: karnoá

[10] ejtsd: peltyié

[11] Ez is egy példa arra, hogy a mintaelőkészítés során kompromisszumokra van szükség.

[12] ejtsd: paraplaszt

[13] L. Purkinje-sejt a kisagyban.

[14] A polilizin fehérje polimer, amely nagyon sok pozitív töltést hordoz, bevonata segíti a metszetek megtapadását.

[15] A hematoxilint oxidálni kell, ezért keverik fémsókkal.

[16] A festődés nem feltétlen háromszínű, az esetleges metakromázia miatt további színek is megjelenhetnek.

[17] l. anatómiai tanulmányok

[18] A kalcium ionok stabilizálják a membránokat.