Szövettani és sejtbiológiai vizsgálómódszerek

Szerkesztette: dr. László Lajos

dr. Csikós György (3. fejezet)

dr. László Lajos (1. és 4. fejezet)

dr. Kovács Attila Lajos (5. fejezet)

dr. Molnár Kinga (2. fejezet)

Pálfia Zsolt (6. fejezet)

dr. Zboray Géza (2. fejezet)

lektorálták 
dr. H.-Minkó Krisztina
dr. Telbisz Ágnes
Kiss István

E könyv kutatási és oktatási célokra szabadon használható. Bármilyen formában való sokszorosítása a jogtulajdonos írásos engedélyéhez kötött.

Készült a TÁMOP-4.1.2.A/1-11/1-2011-0073 számú, „E-learning természettudományos tartalomfejlesztés az ELTE TTK-n” című projekt keretében. Konzorciumvezető: Eötvös Loránd Tudományegyetem, konzorciumi tagok: ELTE TTK Hallgatói Alapítvány, ITStudy Hungary Számítástechnikai Oktató- és Kutatóközpont Kft.


Tartalom

Előszó: célok és lehetőségek
1. A mikrotechnika fogalma
2. Fénymikroszkópia
Különálló, illetve izolált sejtek vizsgálata
Élő sejtek vizsgálata természetes állapotukban, festések nélkül
Élő sejtek festése vitális festékekkel
Sejt- és szövetminta-vételi eljárások
Vérkenet készítése és festése
Csontvelőkenet vizsgálata
Exfoliatív citológiai vizsgálat
Aspirációs biopszia
Egésztest-készítmények vizsgálata
Embriók festése
Átderített porc-csont festett készítmények előállítása
Porcfestés alciánkék-oldattal
Az alizarinvörös és a kombinált alciánkék-alizarinvörös festés
Autoradiográfia
Korróziós készítmények
Vékonycsiszolatok, illetve felületi csiszolatok készítése
Szövettani preparátumok, metszetek készítése
A biológiai anyag előkészítésének általános menete
A mintavétel és a rögzítés néhány szabálya
A rögzítéssel kapcsolatos tudnivalók
Metszetkészítés beágyazás nélkül
Metszetkészítés beágyazással
A szövettani metszetek festése
Hisztokémiai eljárások
A félvékony metszetek
A lefedés
Metszeteken látható néhány gyakori műtermék
A fénymikroszkóp története
Optikai alapfogalmak
Az Abbe-képlet
A fénytörés
Lencsehibák
A fényforrás
Az objektívek típusai és azok feliratai
Az objektíven lévő feliratok és számok jelentése
Erős nagyítású immerziós lencsék használata
A kondenzor és működésének lényege
Az okulárok felépítése és típusai
A mikroszkópi képalkotás és a mikroszkóp beállítása
A fénymikroszkóp képalkotása és nagyítása
A feloldóképesség kihasználása: a Köhler-féle beállítás lépései
Speciális mikroszkóptípusok és mikroszkópi eljárások
Mikroszkópi rajzolóeszköz (camera lucida)
A fáziskontraszt mikroszkóp
A polarizációs mikroszkóp
A differenciál interferencia kontraszt (DIC) mikroszkóp
Az ultramikroszkóp
A sötét látóterű mikroszkóp
A fluoreszcens mikroszkóp
3. Fluoreszcens módszerek
Bevezetés
A fluoreszcencia sajátosságai
Fluoreszkáló molekulák
A fotoelhalványodás jelensége (photobleaching)
Kioltódás (quenching)
Kvantum-kitermelés (quantum-yield, Φ)
Az extinkciós és az emissziós maximumok viszonya
Kötődés, méret, toxicitás és ár
A fluorofór molekulacsaládok
Az autofluoreszcencia
Quantum dots
A fluorokrómokkal való munka általános szabályai
A gerjesztéshez használható fényforrások
Higanygőzlámpa
A lézer fényforrások
LED fényforrások
A fényforrás helye a fluoreszcens mikroszkópokban
A fluoreszcens mikroszkópokban alkalmazott szűrők
A szűrőkocka
Sejtorganellumok szelektív jelölése fluorokrómokkal
Sejtmagfestés
Mitokondriumok kimutatása
Lizoszómák kimutatása
Fluoreszcencia aktivált sejtválogatás és analízis (FACS)
Egyedi molekulák vizsgálata
Immunhisztokémia
Fluoreszkáló fehérjék
Fluoreszkáló fehérjék használata
Fluoreszcencia-visszatérés fotoelhalványodás után (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)
Inverz fluoreszcencia-visszatérés fotoelhalványodás után (inverse fluorescence recovery after photobleaching, iFRAP)
Flourescence loss in photobleaching (FLIP)
Fluoreszcencia lokalizáció fotoelhalványítás után (fluorescence localization after photobleaching, FLAP)
Fotoaktiváció (photo-activation)
Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (fluorescence resonance energy transfer, FRET)
Fluoreszcens in situ hibridizáció (fIuorescence in situ hybridization, FISH)
4. Elektronmikroszkópia
Mi teszi szükségessé az elektronmikroszkóp használatát?
Elektronjelenségek
Az elektronmikroszkóp rövid története
A transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM)
A TEM és a fénymikroszkóp összehasonlítása
A TEM képalkotó elemei
Az elektronmikroszkóp beállítása, lencsehibák
A mikroszkópos munka menete
Minta-előkészítés rutin TEM vizsgálatokra
Anyagpreparálás, rögzítés
Víztelenítés
Beágyazás
A blokk kifaragása, az ultramikrotom működése és a kések
Kontrasztosítás
A kész metszetek vizsgálata
Átágyazás: átjárás a fény- és az elektronmikroszkópos dimenziók között
Műtermékek, hibák
Minta-előkészítés speciális TEM vizsgálatokra
Negatív kontrasztosítás
Citokémia
Immuncitokémia
Az alapok
Ellenanyagok
Elektron-optikai jelzőanyag
Az immunjelölés két módja
Minta-előkészítés és a beágyazás előtti immunjelölés
A beágyazás utáni immunjelölés
Fehérjepreparátum immunarany jelölése
Immunjelölés átágyazott metszeten
Az immuncitokémiai jelölés kontrolljai
Gyakori hibák és azok kiküszöbölése
A pásztázó elektronmikroszkóp (SEM)
5. Soksejtűekből izolált túlélő rendszerek vizsgálata: in vitro (ex vivo) módszerek
Az in vitro kísérleti rendszerekkel kapcsolatos néhány alapvető elvi kérdés
Az in vitro rendszerek fő típusainak vázlatos áttekintése
Az összetettség szintje szerinti csoportosítás: szupra-, szubcelluláris és újraépített rendszerek
Az oxigénnel való ellátás módja szerinti csoportosítás
Teljes embriók in vitro rendszerekben
Kombinált módszerek
Szubcelluláris in vitro rendszerek
Az in vitro rendszerek működésének általános feltételei
Tisztaság és sterilitás
A hőmérséklet
Az in vitro rendszerek vizes közegeinek alapvető tulajdonságai
A perfúziós rendszerek alapvető sajátosságai, néhány gyakrabban használt perfundált szerv
A perfundált máj
Egyéb szervek, testtájak, testrészletek perfúziós rendszerben
Diffúzióval oxigenált organotipikus rendszerek
Szervtenyészetek
Teljes embrió tenyészetek
Szövetszeletek
Izolált sejtcsoportok, sejtek
Sejtizolálás szövettenyésztési célokra
Frissen izolált sejtek, sejtcsoportok
Szövet- és sejttenyészetek
A tenyésztés körülményei
A tenyészetek növekedése és fenntartása
Klónozás és sejtklónok
6. A mikroszkópos morfometria alapjai
Bevezetés
Morfometria
Tradicionális vagy klasszikus morfometria
Geometriai morfometria
Sztereológia
Egy kis statisztika
A statisztikai kiértékelésről
Mintavétel
Az elektronmikroszkópos minta előállításával kapcsolatos feladatok
A mintavétel módszere
A szükséges mérések számának meghatározása
Térfogatarányok (volumenfrakció: VV) meghatározása
Adott térfogatban lévő (SV) felület meghatározása
Adott térfogatban lévő struktúra hosszának (L) meghatározása
A sztereológiában használatos jelölések
7. Függelék
Vérkenet festése
May–Grünvald–Giemsa-festés
Egésztest-festések
Embriók festése
Porcos vázelemek feltüntetése: alciánkék-festés
Csontos vázelemek feltüntetése: alizarinvörös festés
Csont-porc (alciánkék-alizarinvörös) kombinált festés
Általános áttekintésre szolgáló szövettani festések
Sejtmagok festése hematoxilin festéssel
A citoplazma festése
Kombinált mag- és citoplazmafestés
Kötőszövet kimutatása
Azan-festés
Nyálka kimutatása
PAS festés
Lipidek kimutatása
Szudánfekete festés
Oilred festés
Idegszövet festése
Idegrostok festése ozmium-tetroxiddal
Luxol fast blue-krezilibolya festés
Félvékony metszetek festése
Toluidinkék festés
Metilénkék–azúr II festés
Metilénkék–bázikus fukszin festés
Hematoxilin-eozin és Azan-festés
Ezüstimpregnáció
Hisztokémiai reakciók
Gömöri-féle lúgos foszfatáz kimutatás
Gömöri-féle savas foszfatáz kimutatás
Pufferek, pufferrendszerek
Sörensen-féle foszfát puffer
Kakodilátpuffer
Veronal-acetát puffer
Rögzítőszerek, keverékek, kimosók
Neutrális formalin-szukróz
Kalcium tartalmú formalin lipidek rögzítéséhez
Bouin-rögzítőkeverék
Carnoy-keverék
Karnovsky-keverék
Elektronmikroszkópos munkához ajánlott rögzítőkeverékek
Víztelenítés, paraplasztos (paraffinos) beágyazás előtt
Deparaffinálás és rehidrálás
A lefedés előtti dehidrálás és derítés
Beágyazás fénymikroszkópos vizsgálathoz
Beágyazás paraplasztba
Beágyazás elektronmikroszkópos vizsgálathoz
Beágyazószer eltávolítása műgyantába ágyazott félvékony metszetekből
Immuncitokémiai jelölés beágyazás után (postembedding)
Kétlépcsős immunjelölés
Háromlépcsős immunjelölés
Kontrasztosítás
Ultravékony metszetek rutinvizsgálatokhoz
A nem saját ábrák forrása
Filmek